SNS-032對(duì)紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用研究

謝閨娥，杜晶春，董桂蘭，徐霞

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣東 廣州 510182；2.廣州大學(xué)門診部，廣東 廣州 510006)

·論 著·

SNS-032對(duì)紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用研究

謝閨娥1，杜晶春1，董桂蘭2，徐霞1

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣東 廣州 510182；2.廣州大學(xué)門診部，廣東 廣州 510006)

目的 研究細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑SNS-032對(duì)人紫杉醇耐藥MCF-7/TAX乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。方法采用MTT試驗(yàn)檢測(cè)MCF-7/TAX細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥情況以及SNS-032對(duì)紫杉醇耐藥MCF-7/TAX細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；采用Annexin V-FITC/PI雙染試驗(yàn)檢測(cè)SNS-032對(duì)MCF-7/TAX耐藥細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。結(jié)果MCF-7/TAX細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥指數(shù)達(dá)19.39；而SNS-032能顯著抑制MCF-7/TAX耐藥細(xì)胞的增殖，且具有明顯的濃度依賴性，對(duì)其作用48 h的IC50為164.5 nmol/L，MCF-7/TAX對(duì)SNS-032的耐藥指數(shù)僅為0.89。SNS-032作用后，Annexin V染色陽性的MCF-7/TAX細(xì)胞比例較對(duì)照明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論SNS-032能激活MCF-7/TAX耐藥細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而對(duì)紫杉醇耐藥MCF-7/TAX細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮高效抑制作用。

紫杉醇耐藥；SNS-032；MCF-7/TAX；凋亡

細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)中控制著細(xì)胞從靜止期轉(zhuǎn)向生長(zhǎng)增殖期的重要過程，而細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，Cdks)是細(xì)胞周期進(jìn)程中的核心調(diào)控分子[1-2]。細(xì)胞周期調(diào)控異常與細(xì)胞癌變密切相關(guān)，在大多數(shù)惡性腫瘤中存在著Cdks的過度表達(dá)與活化，因此Cdks已成為當(dāng)前腫瘤治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)[1-3]。

作為一種新型Cdk抑制劑，SNS-032對(duì)Cdk2、Cdk7和Cdk9的活性同時(shí)具有很強(qiáng)的抑制作用[4]。已有的研究報(bào)道表明SNS-032可用于多種腫瘤如急性粒細(xì)胞性白血病[5]、慢性淋巴細(xì)胞性白血病[6]、結(jié)腸癌[7]及非小細(xì)胞肺癌[8]等的治療。在乳腺癌中，本課題組前期研究表明，SNS-032在動(dòng)物體內(nèi)、體外均能高效抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[9]。

本研究以紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/TAX為模型，研究SNS-032對(duì)紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性，以期探討該化合物在紫杉醇耐藥乳腺癌治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人MCF-7紫杉醇耐藥細(xì)胞系(MCF-7/taxol-resistant，MCF-7/TAX)購(gòu)買自吉尼歐生物科技有限公司；人MCF-7乳腺癌細(xì)胞系購(gòu)自ATCC；SNS-032為美國(guó)Selleck公司產(chǎn)品；紫杉醇、碘化丙啶(propidium iodide,PI)及二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)產(chǎn)自美國(guó)Hyclone公司；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶及Hepes緩沖液是美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；MTT從美國(guó)Genview公司購(gòu)買；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒從美國(guó)Roche公司購(gòu)買；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7培養(yǎng)于含有10%FBS、100 μg/mL鏈霉素及100 IU/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)液中，MCF-7/TAX紫杉醇耐藥細(xì)胞培養(yǎng)在含1.0 μmol/L紫杉醇的上述培養(yǎng)液中以維持細(xì)胞的耐藥表型，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT比色法 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后制成單細(xì)胞懸液，按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，24 h后加入不同濃度的SNS-032(設(shè)置7個(gè)濃度：25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L、800 nmol/L及1600 nmol/L)或不同濃度的紫杉醇(設(shè)置7個(gè)濃度：0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、1 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L及20 μmol/L)，每個(gè)濃度做3個(gè)平行孔，培養(yǎng)48 h后每孔加20 μL 5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸去培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，振蕩10 min使結(jié)晶完全溶解；用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的吸光度(optical density，OD)值，按以下公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率：抑制率%=(1-OD加藥組/ OD對(duì)照組)×100%，并用Bliss's軟件計(jì)算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。最后按以下公式計(jì)算耐藥指數(shù)(resistance index，RI)：RI=耐藥細(xì)胞MCF-7/TAX的IC50/親本細(xì)胞MCF-7的IC50。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙染法 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/TAX細(xì)胞消化后接種至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜；第2天吸去培養(yǎng)液，加入含400 nmol/L SNS-032的新鮮培養(yǎng)液，8 h后用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后用1×binding buffer將細(xì)胞重懸至1×106個(gè)/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入10 μL PI和5 μL Annexin V-FITC，混勻后室溫避光孵育15 min；最后加400 μL 1×binding buffer混勻，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MCF-7/TAX細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥情況 采用不同濃度紫杉醇作用紫杉醇耐藥細(xì)胞MCF-7/TAX及其親本細(xì)胞MCF-7，MTT試驗(yàn)結(jié)果表明(圖1)，作用48 h后，紫杉醇對(duì)MCF-7的IC50是1.07 μmol/L，而其對(duì)MCF-7/TAX細(xì)胞的IC50是20.75 μmol/L，MCF-7/ TAX對(duì)紫杉醇的耐藥指數(shù)達(dá)19.39(表1)。

圖1 MTT法分析MCF-7/TAX細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥情況

2.2 SNS-032對(duì)紫杉醇耐藥MCF-7/TAX乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況 采用不同濃度SNS-032作用MCF-7/TAX及MCF-7細(xì)胞，MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)，SNS-032能顯著抑制MCF-7/TAX紫杉醇耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，作用48 h后IC50僅為164.5 nmol/L；SNS-032對(duì)MCF-7細(xì)胞作用48 h的IC50是184.0 nmol/L，MCF-7/TAX細(xì)胞對(duì)SNS-032的耐藥指數(shù)僅為0.89(表1)。

細(xì)胞系MCF-7 MCF-7/TAX紫杉醇 SNS-032 IC50(μmol/L) 1.07 20.75 RI -19.39 IC50(nmol/L) 184.0 164.5 RI -0.89

2.3 SNS-032誘導(dǎo)MCF-7/TAX紫杉醇耐藥細(xì)胞凋亡 Annexin V-FITC/PI染色試驗(yàn)結(jié)果表明(圖3)，不加SNS-032的對(duì)照MCF-7/TAX凋亡細(xì)胞比率僅為(1.12±0.44)%；400 nmol/L SNS-032作用8 h后，MCF-7/TAX凋亡細(xì)胞比率達(dá)(25.55±1.93)%，較對(duì)照顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 SNS-032對(duì)MCF-7/TAX細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線

圖3 Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)SNS-032對(duì)MCF-7/TAX細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

3 討 論

Cdks是當(dāng)前治療腫瘤的熱門靶點(diǎn)，一些Cdk抑制劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)并顯示出良好的應(yīng)用前景。Ⅰ期臨床試驗(yàn)表明Cdk抑制劑能安全地用于晚期癌癥患者，安全性較高，增加劑量即可達(dá)到較理想的藥物動(dòng)力學(xué)效果。Ⅱ期臨床研究表明，一些Cdk抑制劑具有一定的抗癌作用，而將Cdk抑制劑與細(xì)胞毒性化療藥物聯(lián)合起來作用腫瘤細(xì)胞更是顯示出良好的前景[10]。

作為一種新型Cdk抑制劑，SNS-032對(duì)Cdk2、Cdk7和Cdk9的活性同時(shí)具有很強(qiáng)的抑制作用。與第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)并顯示出良好應(yīng)用前景的Cdk抑制劑flavopiridol比較，SNS-032展現(xiàn)出更強(qiáng)的體外腫瘤細(xì)胞殺傷作用，并具有更高的腫瘤細(xì)胞選擇性和較小的毒副作用[6]?，F(xiàn)有研究表明SNS-032對(duì)多種血液惡性腫瘤及實(shí)體瘤具有抗腫瘤活性[5-8]。本課題組前期對(duì)SNS-032在乳腺癌中的作用展開了研究，結(jié)果表明SNS-032也能高效抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[9]。

紫杉醇廣泛應(yīng)用于包括乳腺癌在內(nèi)的臨床各類腫瘤的化療，然而腫瘤對(duì)紫杉醇耐藥性的發(fā)生嚴(yán)重影響了臨床治療效果[11]，開發(fā)對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞也敏感的新型化療藥物迫在眉睫。為此，在課題組前期首次報(bào)道SNS-032能高效抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的研究基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討SNS-032對(duì)紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞的抗腫瘤活性。MTT試驗(yàn)表明，MCF-7/TAX紫杉醇耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥指數(shù)達(dá)19.39；而SNS-032處理MCF-7/TAX耐藥細(xì)胞48 h后的IC50僅為164.5 nmol/L，MCF-7/TAX對(duì)SNS-032的耐藥指數(shù)僅為0.89，說明SNS-032能抵抗紫杉醇耐藥乳腺癌細(xì)胞的耐藥性，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)揮顯著抑制作用。

細(xì)胞凋亡抵抗是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，也是引發(fā)腫瘤化療耐藥的一個(gè)重要機(jī)制。激活腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)生的能力，是腫瘤治療的有效方法[12]。本研究Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，經(jīng)SNS-032處理后，Annexin V-FITC陽性的MCF-7/TAX細(xì)胞比率顯著升高，說明SNS-032能克服凋亡抵抗，激活MCF-7/ TAX紫杉醇耐藥細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本研究結(jié)果證實(shí)，SNS-032能激活MCF-7/TAX細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而對(duì)紫杉醇耐藥MCF-7/TAX乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)揮高效抑制作用，這將為探索SNS-032在紫杉醇耐藥乳腺癌治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Gallorini M,Cataldi A,di Giacomo V.Cyclin-dependent kinase modulators and cancer therapy[J].Bio Drugs,2012,26(6):377-391.

[2]Canavese M,Santo L and Raje N:Cyclin dependent kinases in cancer:potential for therapeutic intervention[J].Cancer Biol Ther, 2012,13(7):451-457.

[3]Lapenna S,Giordano A.Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer[J].Nat Rev Drug Discov,2009,8(7):547-566.

[4]Conroy A,Stockett DE,Walker D,et al.SNS-032 is a potent and selective CDK 2,7 and 9 inhibitor that drives target modulation in patient samples[J].Cancer Chemother Pharmacol,2009,64(4): 723-732.

[5]Walsby E,Lazenby M,Pepper C,et al.The cyclin-dependent kinase inhibitor SNS-032 has single agent activity in AML cells and is highly synergistic with cytarabine[J].Leukemia,2011,25(3):411-419.

[6]Chen R,Wierda WG,Chubb S,et al.Mechanism of action of SNS-032,a novel cyclin-dependent kinase inhibitor,in chronic lymphocytic leukemia[J].Blood,2009,113(19):4637-4345.

[7]Boquoi A,Chen T,Enders GH.Chemoprevention of mouse intestinal tumorigenesis by the cyclin-dependent kinase inhibitor SNS-032[J]. Cancer Prev Res(Phila),2009,2(9):800-806.

[8]Kodym E,Kodym R,Reis AE,et al.The small-molecule CDK inhibitor,SNS-032,enhances cellular radiosensitivity in quiescent and hypoxic non-small cell lung cancer cells[J].Lung Cancer,2009,66(1): 37-47.

[9]Xie G,Tang H,Wu S,et al.The cyclin-dependent kinase inhibitor SNS-032 induces apoptosis in breast cancer cells via depletion of Mcl-1 and X-linked inhibitor of apoptosis protein and displays antitumor activity in vivo[J].Int J Oncol,2014,45(2):804-812.

[10]付文鋒,劉天礽.細(xì)胞周期抑制劑治療腫瘤的進(jìn)展[J].實(shí)用臨床醫(yī)學(xué),2015,16(10):97-101.

[11]Fojo T,Menefee M.Mechanisms of multidrug resistance:the potential role of microtubule-stabilizing agents[J].Ann Oncol,2007,18 (Suppl 5):v3-8.

[12]Ghobrial IM,Witzig TE,Adjei AA.Targeting apoptosis pathways in cancer therapy[J].CACancer J Clin,2005,55(3):178-194.

Anti-proliferative effect of SNS-032 on taxol-resistant breast cancer cells.

XIE Gui-e1,DU Jing-chun1,DONG Gui-lan2,XU Xia1.1.KingMed School of Laboratory Medicine,Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182, Guangdong,CHINA;2.Outpatient Department,Guangzhou University,Guangzhou 510006,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of the cyclin-dependent kinase inhibitor SNS-032 on the growth of taxol-resistant MCF-7/TAX breast cancer cells.MethodsThe resistance situation of MCF-7/TAX cells to paclitaxel and the effect of SNS-032 on the growth of taxol-resistant MCF-7/TAX cells were evaluated by MTT(3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide)assay.The effect of SNS-032 on apoptosis in MCF-7/TAX cells was analyzed by Annexin V-FITC/PI staining.ResultsThe resistance index of MCF-7/TAX cells to paclitaxel was 19.39.After treatment with SNS-032 for 48 h,MCF-7/TAX cells displayed markedly inhibited growth in a dose-dependent manner,and calculated IC50 was 164.5 nmol/L.SNS-032 decreased the resistance index of MCF-7/TAX from 19.39 to 0.89.The numbers of apoptotic MCF-7/TAX cells,as revealed by Annexin V binding,significantly increased upon SNS-032 treatment(P＜0.05).ConclusionThe results demonstrate that SNS-032 can induce apoptosis in MCF-7/TAX cells and consequently display potent cytocidal effect on taxol-resistant MCF-7/TAX breast cancer cells.

Taxol resistance;SNS-032;MCF-7/TAX;Apoptosis

R737.9

A

1003—6350（2017）03—0345—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.03.001

2016-09-09)

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81101682）；廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)資金（編號(hào)：2014A020212015）

徐霞。E-mail：xux2014@126.com