肝X受體激動(dòng)劑GW3965對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞奧沙利鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)作用及機(jī)制

譚湘洲，王然，文俏程，莫硯群，吳瑞平，陳志康

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 結(jié)直腸肛門外科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

結(jié)直腸癌早已被列入威脅人類健康的惡性腫瘤行列，其在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率位居十大惡性腫瘤的第3位[1]。近年來，不僅結(jié)直腸癌新發(fā)病例逐年增加，且有20%～25%的新發(fā)病例在確診時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。外科手術(shù)治療技術(shù)雖進(jìn)步飛速，但對(duì)于進(jìn)展期結(jié)直腸癌的治療仍需依靠聯(lián)合手術(shù)、化療、放療等全身綜合治療。奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA），作為第3代鉑類藥物，目前已成為進(jìn)展期結(jié)腸癌化療的一線藥物，它通過與DNA共價(jià)結(jié)合形成鉑類-DNA加和物，破壞DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[3]。盡管如此，進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者對(duì)OXA的初始有效率也僅有20%～30%，所以在目前的化療方案中，大多采用聯(lián)合給藥方案，以提高有效率，降低藥物毒副反應(yīng)。然而隨著治療的進(jìn)行，進(jìn)展期結(jié)腸癌患者對(duì)OXA逐步產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥而出現(xiàn)化療失敗[4]。因此，如何有效逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)OXA的耐藥，提高其對(duì)OXA的敏感性，是臨床亟待解決的難題。

自噬，是細(xì)胞在多種生理及病理生理?xiàng)l件下，通過動(dòng)態(tài)改變亞細(xì)胞膜形態(tài)使得胞內(nèi)細(xì)胞器和蛋白降解的分解代謝過程。目前已證實(shí)，包括結(jié)直腸癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞可通過自噬獲得耐藥性從而躲避化療藥物的損傷作用[5]。

肝X受體（liver x receptor，LXR），作為核受體家族的成員，在膽固醇、脂肪酸及糖類代謝的過程中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。近年來，其抗腫瘤作用正被逐步發(fā)現(xiàn)。LXR激動(dòng)劑GW3965已被證實(shí)可通過阻滯細(xì)胞周期抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的體外生長(zhǎng)[6]，本研究致力于LXR激動(dòng)劑對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞耐OXA細(xì)胞HCT-116/L-OHP的化療敏感性及自噬水平的影響，旨在揭示其可能的作用機(jī)制，為臨床化療增敏提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

細(xì)胞：人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室。主要試劑：LXR激動(dòng)劑GW3965購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。注射用OXA購(gòu)自Selleck公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所；兔抗人ATG-5多克隆抗體、兔抗人Beclin-1多克隆抗體、兔抗人LC3單克隆抗體、兔抗人p62單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司、鼠抗人GAPDH多克隆抗體購(gòu)自上海康成公司；羊抗兔和羊抗鼠二抗（熒光標(biāo)記）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。實(shí)驗(yàn)儀器：超凈工作臺(tái)、CO2恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、-80 ℃冰箱、顯微鏡、天平、高速低溫離心機(jī)、恒溫水浴鍋、電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀等儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及構(gòu)建 采用OXA藥物濃度持續(xù)遞增誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞，首先將2.5 μmol/L OXA加入培基中培養(yǎng)，連續(xù)4個(gè)周期，逐漸增加OXA濃度（2.5、5、10、20、30、40、45 μmol/L），直至細(xì)胞可在含45 μmol/L OXA的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，此時(shí)HCT116/L-OHP細(xì)胞構(gòu)建成功。分別將HCT-116、HCT-116/L-OHP細(xì)胞加入10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置入37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)36～48 h換液。細(xì)胞鋪滿80%培養(yǎng)瓶時(shí)，常規(guī)胰酶消化、離心，傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116、HCT116/L-OHP細(xì)胞，胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，按照5 000/孔接種于96孔板，每組均設(shè)4個(gè)孔，采用CCK-8法連續(xù)7 d測(cè)定各組的吸光度（OD值），繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 細(xì) 胞 對(duì) OXA耐 受 性 變 化 ⑴ 測(cè) 定HCT116、HCT116/L-OHP對(duì)OXA的耐受性變化：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116/L-OHP細(xì)胞，胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照5 000個(gè)/孔將2種細(xì)胞接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的 OXA（2.5、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L），對(duì)照組加等數(shù)量細(xì)胞及等體積完全培養(yǎng)基，空白組僅加等體積的完全培養(yǎng)基，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后加入10% CCK8 100 μL， 溫 箱 孵 育 1.5 h 后 用 全 自 動(dòng) 酶 標(biāo) 儀 在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用SPSS 21.0軟件計(jì)算出各組細(xì)胞半數(shù)抑制濃度（IC50），抑制率（%）=1-（實(shí)驗(yàn)組平均OD值空白組平均OD值）/（對(duì)照組平均OD值-空白組平均OD值）×100%；耐藥指數(shù)（resistance index，RI）=耐藥細(xì)胞株IC50/親本細(xì)胞IC50。⑵ 測(cè)定不同濃度GW3965處理后HCT-116/LOHP對(duì)OXA的耐藥性變化：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116、HCT116/L-OHP細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按10 000個(gè)/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，分別以含不同濃度GW3965（10、20、30 μmol/L）+DMSO 0.01% 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HCT116/L-OHP，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，其內(nèi)只加入 DMSO 0.01%，GW3965作用 48 h后，各組細(xì)胞加入不同濃度的OXA（0、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L），每組均設(shè) 3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h 后加入 10% CCK8 100 μL，溫箱孵育 1.5 h 后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按照上法計(jì)算出各組IC50、RI、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。其中逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=實(shí)驗(yàn)組IC50/空白對(duì)照組IC50。

1.2.4 細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116/LOHP細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制備細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，分別接種于4個(gè)相同的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，采用不同濃度（0、10、20、30 μmol/L）的GW3965處理48 h后，各組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取50 μg蛋白質(zhì)樣品于100 ℃加熱變性后上樣，經(jīng)8%SDS-PAGE 電泳分離后，依次進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗孵育。其中兔抗人ATG-5多克隆抗體1:10 000稀釋，兔抗人Beclin-1多克隆抗體1:2 000稀釋，兔抗人LC3單克隆抗體1:3 000，兔抗人p62單克隆抗體1:1 000，兔抗人 GAPDH 抗體 1:10 000稀釋，羊抗兔二抗 1:10 000稀釋。采用 Bio-Rad ChemiDoc MP凝膠成像分析系統(tǒng)顯影、拍照。用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析，以各目的蛋白與內(nèi)參（GAPDH）的灰度比值表示各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，3組及以上樣本用Kuskal-WallisH檢驗(yàn)進(jìn)行分析，兩樣本分布是否有差異性用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人結(jié)腸癌OXA耐藥細(xì)胞株HCT-116/L-OHP的建立

采用OXA藥物濃度持續(xù)遞增誘導(dǎo)的方法，歷時(shí)6個(gè)月獲得可耐受45 μmol/L OXA濃度并正常生長(zhǎng)的人結(jié)腸癌OXA耐藥HCT116/L-OHP細(xì)胞，且反復(fù)傳代、凍存、復(fù)蘇后，復(fù)測(cè)其RI不變。

HCT116細(xì)胞、HCT116/L-OHP細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線見圖1，在第1～4天時(shí)H C T 1 1 6細(xì)胞與HCT116/L-OHP細(xì)胞的增殖速度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），但在第5～7天，HCT116細(xì)胞的增殖速度明顯高于HCT116/L-OHP細(xì)胞（均P＜0.05）。

不同濃度的OXA對(duì)HCT116細(xì)胞抑制率均明顯高于HCT116/L-OHP細(xì)胞（均P＜0.05）（圖2）。由概率單位回歸分析求出HCT116細(xì)胞、HCT116/L-OHP細(xì)胞48 h的IC50分別為（10.05±0.73）μmol/L、（244.99±10.33）μmol/L，HCT116/L-OHP的RI為24.45±1.66，兩組IC50差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 HCT116細(xì)胞與HCT116/L-OHP細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線1）與HCT116細(xì)胞比較，P＜0.05Figure 1 The growth curves of HCT116 and HCT116/L-OHP cells 1) P＜0.05 vs. HCT116 cells

圖2 不同濃度OXA對(duì)HCT116細(xì)胞與HCT116/L-OHP細(xì)胞的抑制情況 1）與HCT116細(xì)胞比較，P＜0.05Figure 2 The inhibitory effects of different concentrations of OXA on HCT116 and HCT116/L-OHP cells 1) P＜0.05 vs. HCT116 cells

2.2 LXR激動(dòng)劑GW3965對(duì)HCT116/L-OHP細(xì)胞OXA耐藥的逆轉(zhuǎn)作用

CCK8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度（10、20、30 μmol/L）GW3965作用于HCT116/L-OHP細(xì)胞48 h，并經(jīng)48 h連續(xù)OXA處理后，細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖均受到明顯抑制，并呈濃度依賴性，與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖3）。

不同濃度（10、20、30 μmol/L）GW3965作用后HCT116/L-OHP細(xì)胞對(duì)OXA的IC50、RI較對(duì)照組（0 μmol/L GW3965）明顯降低，且隨著GW3965的濃度升高而降低更加明顯（均P＜0.05）。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)也隨著GW3965濃度增加而遞增（表1）。

圖3 不同濃度GW3965對(duì)HCT116/L-OHP細(xì)胞OXA耐藥的逆轉(zhuǎn)作用Figure 3 The reversal effects of different concentrations of GW3965 on OXA resistance in HCT116/L-OHP cells

表1 不同濃度GW3965作用后HCT116/L-OHP細(xì)胞對(duì)OXA的IC50、RI、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（±s）Table 1 The IC50,RI and reversal fold to OXA in HCT116/L-OHP cells after exposure to different concentrations of GW3965 (±s)

表1 不同濃度GW3965作用后HCT116/L-OHP細(xì)胞對(duì)OXA的IC50、RI、逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（±s）Table 1 The IC50,RI and reversal fold to OXA in HCT116/L-OHP cells after exposure to different concentrations of GW3965 (±s)

注：1）與 0 μmol/L GW3965 組比較，P＜0.01 Note:P＜0.01 vs. 0 μmol/L GW3965 group

2.3 LXR激動(dòng)劑GW3965對(duì)HCT-116/LOHP細(xì)胞自噬水平的影響

Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度GW3965（10、20、30 μmol/L）處理人結(jié)腸癌耐OXA細(xì)胞48 h后，自噬相關(guān)蛋白ATG-5、Beclin-1的表達(dá)水平隨GW3965濃度的增加而下降，而p62的表達(dá)水平隨GW3965濃度的增加上升，與對(duì)照組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖4）。脂化后與自噬體膜結(jié)合的LC3-II蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，且呈濃度依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖5）。

圖5 LC3蛋白表達(dá)水平檢測(cè)Figure 5 Determination of protein expressions of LC3

3 討 論

GW3965是一種LXR的配體，可激活LXR信號(hào)通路，是某些病理過程如血管性疾病、代謝性疾病、神經(jīng)退行性病變等的潛在治療靶點(diǎn)。Pommier等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，在人類前列腺癌中，LXR激動(dòng)劑可調(diào)控mTOR信號(hào)通路的上游信號(hào)PI3K/AKT等來發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。Vedin等[8-9]的研究表明LXR配體處理后的人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖受到抑制，SKP2（S-phase kinase-associated protein 2）的轉(zhuǎn)錄及蛋白水平被下調(diào)，同時(shí)周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinases，CDKs）及原癌基因MYC的表達(dá)水平也有所下調(diào)。其中SKP2、CDKs以及MYC與腫瘤細(xì)胞的周期密切相關(guān)。這表明LXR與生長(zhǎng)因子信號(hào)通路之間的關(guān)系，可能是調(diào)控細(xì)胞周期的上游信號(hào)通路。LXR配體也可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝基因來發(fā)揮其抗腫瘤的作用，F(xiàn)ukuchi等[10]的研究表明在前列腺癌中，ATP結(jié)合的盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1（ATP-binding cassette sub-family A member 1，ABCA1）的表達(dá)降低，ABCA1低表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞增殖，ABCA1作為L(zhǎng)XR的靶基因，其功能為促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂的流出，在膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)和高密度脂蛋白的生成有著重要的作用。這表明LXR信號(hào)可通過ABCA1來調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖。越來越多的證據(jù)表明LXR可通過改變細(xì)胞脂類代謝、抑制細(xì)胞增殖以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮重要的抑瘤作用[11-13]。本研究表明LXR激動(dòng)劑GW3965能夠逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌耐OXA細(xì)胞株HCT116/L-OHP對(duì)OXA的耐藥性，從而增加化療藥物OXA對(duì)耐藥細(xì)胞株的抑瘤作用，并且隨著GW3965的濃度增加，其抑瘤作用越強(qiáng)。該結(jié)果提示GW3965可能是一種潛在的化療增敏劑，從而增加OXA等化療藥物的抗腫瘤作用。

大多數(shù)腫瘤患者化療失敗的首要原因是因?yàn)楂@得性耐藥的產(chǎn)生[14]。已知的結(jié)腸癌化療耐藥的主要機(jī)制包括慢性缺氧[15]、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]、CpG島甲基化[17]、錯(cuò)配修復(fù)基因的缺失[18]、細(xì)胞亞群存在[19]、KRAS及P53基因突變[20-21]等。其中細(xì)胞自噬也是導(dǎo)致結(jié)腸癌耐藥性的機(jī)制之一。多項(xiàng)研究已證實(shí)，自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，研究者們發(fā)現(xiàn)在胰腺癌、食管癌[23]和宮頸癌[24]等腫瘤細(xì)胞的耐藥性隨著自噬活性的升高而增加，而通過基因敲除、沉默自噬相關(guān)蛋白如Beclin-1、給予自噬抑制劑3-MA等途徑抑制自噬后，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性均顯著增強(qiáng)[24-26]。而在結(jié)腸癌細(xì)胞中，Liu等[27]也發(fā)現(xiàn)在使用不同濃度的OXA處理結(jié)腸癌細(xì)胞后，其自噬水平隨著OXA濃度的增加而升高，即OXA可通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬，使癌細(xì)胞免受藥物毒性作用。自噬相關(guān)的調(diào)控因子及信號(hào)通路主要包括：mTOR信號(hào)通路、Beclin1相關(guān)調(diào)控途徑、Atg蛋白、P53、自噬相關(guān)蛋白LC3等。DeYoung等[28]研究表明，作為L(zhǎng)XR信號(hào)通路相關(guān)分子Redd1可通過激活抑瘤蛋白TSC1/2而下調(diào)mTOR信號(hào)通路的活性。秦溶等[6]的研究也表明，LXR激動(dòng)劑GW3965能抑制人結(jié)腸癌HCT116和LoVo細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與AMPK以及mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。其中mTOR作為細(xì)胞生長(zhǎng)的中心調(diào)節(jié)因子，是多條調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬信號(hào)通路的重要匯聚點(diǎn)[29]。本研究表明，LXR激動(dòng)劑GW3965作用后的人結(jié)腸癌耐OXA細(xì)胞株的自噬相關(guān)蛋白Atg5、Beclin1的相對(duì)蛋白表達(dá)水平降低，而自噬相關(guān)蛋白p62的相對(duì)蛋白表達(dá)水平增高，該結(jié)果表明，GW3965作用后的人結(jié)腸癌耐OXA細(xì)胞株的自噬活性降低，其機(jī)制可能與mTOR信號(hào)通路、Beclin1相關(guān)調(diào)控途徑、ATG蛋白等相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。但有趣的是，自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)水平在GW3965作用后反而增高。LC3為一種微管相關(guān)蛋白，是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白，細(xì)胞內(nèi)存在兩種形式，即LC3-I和LC3-II。當(dāng)自噬體形成時(shí)，LC3-I則通過剪切以及泛素化加工修飾，并與磷脂酰乙醇胺（PE）偶聯(lián)，形成膜結(jié)合形式的LC3-II，定位于自噬體內(nèi)外膜上。Ichimura等[30-31]研究認(rèn)為，LC3-II水平的升高代表著自噬體結(jié)構(gòu)的增加，即細(xì)胞內(nèi)自噬水平的提高。顯然這種結(jié)果與Atg5、Beclin1及p62提示的自噬活性降低完全相反。這種現(xiàn)象的發(fā)生可能是由于自噬溶酶體降解功能下降或者自噬體與溶酶體融合遲緩所導(dǎo)致的。自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，而自噬體也僅僅只是整個(gè)自噬通路過程中的一個(gè)中間結(jié)構(gòu)，該種情況下的LC3-II的表達(dá)并不能真實(shí)反映其自噬水平。

綜上所述，本研究證實(shí)GW3965可以提高人結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥株對(duì)OXA的化療敏感性，同時(shí)降低其自噬水平，提示GW3965可能通過抑制細(xì)胞自噬蛋白水平逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌耐OXA細(xì)胞HCT116/L-OHP的耐藥性，其機(jī)制可能與mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Beclin-1相關(guān)調(diào)控途徑以及ATG蛋白等有關(guān)。接下來，可進(jìn)一步通過驗(yàn)證揭示GW3965增加結(jié)腸癌細(xì)胞化療敏感性的機(jī)制與細(xì)胞自噬的聯(lián)系，以期為結(jié)腸癌化療耐藥這一臨床難題出謀獻(xiàn)計(jì)。

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