高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方褪黑激素片中維生素B6與褪黑激素的含量

徐碩　徐文峰　金鵬飛

[摘要] 目的 應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，建立同時(shí)測(cè)定復(fù)方褪黑激素片中維生素B6和褪黑激素含量的方法。 方法 采用Alltima C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），以50 mmol/L磷酸二氫銨溶液（磷酸調(diào)至pH 3.0）-乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣體積10 μL，對(duì)復(fù)方褪黑激素片中的維生素B6和褪黑激素進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果 維生素B6和褪黑激素檢測(cè)濃度分別在80.34～401.7 mg/L（r=0.9997）和8.50～42.5 mg/L（r=0.9999）范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系；精密度和穩(wěn)定性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均<0.8%；回收率良好，維生素B6和褪黑激素的平均回收率（n=9）分別為100.4%和98.86%，RSD分別為0.42%和0.86%。復(fù)方褪黑激素片中維生素B6平均含量為14.14 mg/片，褪黑激素平均含量為0.9853 mg/片。 結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速，可用于同時(shí)測(cè)定復(fù)方褪黑激素片中維生素B6和褪黑激素的含量。

[關(guān)鍵詞] 維生素B6；褪黑激素；高效液相色譜；含量測(cè)定

[中圖分類(lèi)號(hào)] R927.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）01（c）-0142-05

[Abstract] Objective To develop a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the simultaneous determination of vitamin B6 and melatonin in Compound Melatonin Tablets. Methods An Alltima C18 column （150 mm × 4.6 mm， 5 μm） was used for the separation， with gradient elution of 50 mmol/L ammonium dihydrogen phosphate （adjusted pH to 3.0 with H3PO4） and acetonitrile as the mobile phase at the flow rate of 0.5 mL/min. The detection wavelength was set at 278 nm. The column temperature was 30℃ and injection volume was 10 μL. Vitamin B6 and melatonin in Compound Melatonin Tablets were quantified by the established method. Results The liner range of vitamin B6 and melatonin was 80.34-401.7 mg/L （r=0.9997） and 8.50-42.5 mg/L （r=0.9999） respectively. The precision and stability were satisfactory， and the relative standard deviation （RSD） were less than 0.8%. The average recoveries （n=9） was 100.4% （RSD=0.42%） and 98.86% （RSD=0.86%） for vitamin B6 and melatonin respectively. The average contents of vitamin B6 and melatonin in Compound Melatonin Tablets were 14.14 mg/tablet and 0.9853 mg/tablet. Conclusion The established method is accurate， simple and rapid， and can be utilized for simultaneous determination of vitamin B6 and melatonin in Compound Melatonin Tablets.

[Key words] Vitamin B6； Melatonin； HPLC； Determination

褪黑激素（melatonin，MLT）化學(xué)名稱(chēng)為N-乙?；?5-甲氧基色胺，主要是由哺乳動(dòng)物和人類(lèi)松果體產(chǎn)生、分泌的一種吲哚類(lèi)物質(zhì)[1-2]。褪黑激素是一種人體內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑，可將內(nèi)源性生物節(jié)律的周期、位相調(diào)整到與環(huán)境周期同步，具有鎮(zhèn)靜、催眠、調(diào)節(jié)睡眠-覺(jué)醒、改善時(shí)差反應(yīng)綜合征的作用。在延續(xù)人體衰老和抵抗老年性疾病方面具有一定作用，某些腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展也與褪黑激素的獨(dú)特晝夜排泌節(jié)律相關(guān)[1，3-6]。維生素B6對(duì)智力和體力的提高具有促進(jìn)作用，能調(diào)節(jié)血液中的葡萄糖水平，維持甲狀腺、腎上腺和性腺的正常功能，改善大腦物質(zhì)的新陳代謝[7-9]。復(fù)方褪黑激素片是以高純度的褪黑素、維生素B6為原料制成的具有改善睡眠作用的保健品，適用于失眠者、睡眠質(zhì)量差、易驚醒者，片劑中加入維生素B6有助于提高免疫力。

隨著生命科學(xué)研究的不斷深入，人工合成褪黑激素的工藝已完成，該物質(zhì)作為保健食品被廣泛應(yīng)用。保健品中有效成分的含量高低對(duì)于保證其質(zhì)量穩(wěn)定，發(fā)揮特定功能方面具有重要意義，因此對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定是很有必要的。雖然已有報(bào)道，褪黑激素和維生素B6的含量測(cè)定方法[1-3，9-23]，但同時(shí)對(duì)這兩種成分進(jìn)行含量測(cè)定的研究還未見(jiàn)報(bào)道。褪黑激素與維生素B6的化學(xué)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和色譜行為差異大，因此實(shí)現(xiàn)同時(shí)分析的難度較大。文獻(xiàn)報(bào)道的維生素B6含量測(cè)定方法使用離子對(duì)高效液相色譜法（HPLC）[9，13-23]，長(zhǎng)期運(yùn)行對(duì)色譜柱損害較大。

本研究應(yīng)用HPLC技術(shù)，首次建立了同時(shí)測(cè)定保健品復(fù)方褪黑激素片中維生素B6和褪黑激素含量的方法，該方法準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)，避免了離子對(duì)試劑、液相系統(tǒng)的損害，樣品制備操作簡(jiǎn)便，可用于其質(zhì)量控制，具有一定參考價(jià)值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260液相系統(tǒng)：配有G1311C四元梯度泵，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G4212B DAD檢測(cè)器（Agilent Technologies，美國(guó)）；Mettler XP-205電子天平（瑞士，梅特勒公司）；KQ-800KDE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Millipore超純水處理系統(tǒng)。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司，批號(hào)：157753）；磷酸（色譜純，瑞士Fluka公司，批號(hào)：BCBB0522）；磷酸二氫銨（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130121）；甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150917）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。維生素B6（鹽酸吡多辛）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100116-200502，純度100%）；褪黑激素對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，純度98%）。復(fù)方褪黑激素片（規(guī)格：含維生素B6 12.2 mg/片，褪黑激素1 mg/片，批號(hào)：2067119、2057676和2049624，美國(guó)Natrol公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Alltima C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：50 mmol/L磷酸二氫銨溶液（磷酸調(diào)至pH 3.0）（A）-乙腈（B），梯度洗脫（梯度變化程序見(jiàn)表1），流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。在上述色譜條件下，維生素B6和褪黑激素色譜峰的理論塔板數(shù)分別為15 773和255 960。進(jìn)樣前，所有溶液均用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)。見(jiàn)表1。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取維生素B6對(duì)照品約200 mg、褪黑激素對(duì)照品約20 mg，置100 mL量瓶中，加入甲醇-水（15∶85）適量，超聲使溶解，用甲醇-水（15∶85）稀釋至刻度，搖勻，即為混合儲(chǔ)備液。再精密量取混合儲(chǔ)備液1、2、2.5、3、5 mL于25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，獲得維生素B6濃度約為80、160、200、240、400 mg/L，褪黑激素濃度約為8、16、20、24、40 mg/L混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取片劑20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取粉末適量（約相當(dāng)于維生素B6 10 mg，褪黑激素1 mg），置于50 mL量瓶中，加入甲醇-水（10∶90）適量，超聲30 min，加甲醇-水（10∶90）稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性溶液的制備

依據(jù)保健品說(shuō)明書(shū)提供的配方，配制不含維生素B6和褪黑激素的空白溶液，按“2.3”項(xiàng)下操作，制備陰性溶液。

2.5 專(zhuān)屬性和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別對(duì)陰性溶液、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣分析，考察樣品中其他成分和輔料對(duì)定量的干擾。陰性溶液、混合對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜圖顯示：樣品中其他成分和輔料不干擾維生素B6和褪黑激素的測(cè)定。維生素B6和褪黑激素的分離度良好，理論板數(shù)均> 15 000。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.6 線(xiàn)性關(guān)系考察、檢測(cè)限及定量限

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下各濃度對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到回歸方程和線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)（r）。維生素：B6 Y=26 480X+180.52，r=0.9997，線(xiàn)性范圍80.34～401.7 mg/L；褪黑激素：Y=27 590X+2.6193，r=0.9999，線(xiàn)性范圍8.50～42.5 mg/L。

將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋后，以信噪比（S/N）約為3.0時(shí)的濃度為各成分的檢測(cè)限（LOD），S/N約為10.0時(shí)的濃度為各成分的定量限（LOQ），測(cè)得維生素B6的LOD和LOQ分別為0.0086、0.026 mg/L，測(cè)得褪黑激素的LOD和LOQ分別為0.085、0.28 mg/L。

2.7 精密度試驗(yàn)

對(duì)批號(hào)為2067119的一份供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到維生素B6和褪黑激素色譜峰峰面積的RSD分別為0.021%和0.19%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)批號(hào)2067119的樣品獨(dú)立制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣分析，計(jì)算得到維生素B6和褪黑激素含量的RSD分別為2.21%和1.52%（n=6），說(shuō)明方法的重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

取空白基質(zhì)約0.29 g，精密稱(chēng)定，再分別精密加入“2.2”項(xiàng)下混合儲(chǔ)備液4、5、6 mL，按照“2.3”項(xiàng)下操作，制備各回收率溶液，進(jìn)樣測(cè)定。每個(gè)濃度制備3份，共9份樣品。以實(shí)際測(cè)得量和理論加入量的比值作為回收率，計(jì)算回收率的RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。表明方法回收率良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

對(duì)批號(hào)為2067119的供試品溶液分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，計(jì)算得到24 h內(nèi)維生素B6和褪黑激素色譜峰峰面積的RSD分別為0.11%和0.76%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.11 樣品測(cè)定

應(yīng)用建立的方法對(duì)批號(hào)為2067119、2057676、2049624的復(fù)方保健品片進(jìn)行含量測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定2份，取平均值。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

維生素B6的紫外譜圖在218、256、292、326 nm處有最大吸收，褪黑激素的紫外譜圖在198、224、278 nm處有最大吸收，褪黑激素在樣品中含量較低，兼顧兩種成分綜合考慮，選擇278 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

維生素B6為水溶性維生素，極性大，在堿液中易破壞，在酸液中穩(wěn)定，褪黑激素與維生素B6化學(xué)結(jié)構(gòu)不相關(guān)，理化性質(zhì)和色譜行為差異大，因此實(shí)現(xiàn)同時(shí)分析的難度較大。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、甲醇-20 mmol/L磷酸二氫銨（磷酸調(diào)至pH 3.0）、甲醇-50 mmol/L磷酸二氫銨、甲醇-0.04%戊烷磺酸鈉（用冰醋酸調(diào)至pH 3.0）、乙腈-10 mmol/L磷酸二氫銨（含0.01%庚烷磺酸鈉）、乙腈-10 mmol/L磷酸二氫銨（含0.01%庚烷磺酸鈉，用磷酸調(diào)至pH 3.0）、乙腈-50 mmol/L磷酸二氫銨、乙腈-50 mmol/L磷酸二氫銨（磷酸調(diào)至pH 3.0）作為流動(dòng)相對(duì)維生素B6和褪黑激素色譜峰的影響。發(fā)現(xiàn)維生素B6峰形受流動(dòng)相影響較大，色譜峰容易出現(xiàn)前延或拖尾，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較多種流動(dòng)相發(fā)現(xiàn)，以乙腈-50 mmol/L磷酸二氫銨（磷酸調(diào)至pH 3.0）為流動(dòng)相時(shí)兩種目標(biāo)成分峰形均很好，對(duì)稱(chēng)因子為1.0，維生素B6和褪黑激素色譜峰的理論塔板數(shù)分別為15 773和255 960。目前國(guó)內(nèi)外測(cè)定維生素B6文獻(xiàn)報(bào)道大多需采用含有離子對(duì)試劑的流動(dòng)相[9，13-23]，長(zhǎng)期運(yùn)行會(huì)對(duì)液相系統(tǒng)和色譜柱造成較大損害，而本研究使用的流動(dòng)相不需離子對(duì)試劑，且通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，維生素B6色譜峰的對(duì)稱(chēng)性及理論塔板數(shù)更好。因兩種成分極性差異較大，用等度條件難以同時(shí)洗脫出來(lái)?？疾炝瞬煌荻认疵摮绦蛞约氨容^了不同流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）的影響，在最終采用的色譜條件下兩種成分的保留時(shí)間適宜，方便分析檢測(cè)。

3.3 提取溶劑的選擇

本研究比較了用甲醇-水（50∶50）、甲醇-水（20∶80）、甲醇-水（10∶90）作為提取溶劑對(duì)維生素B6和褪黑激素的影響。結(jié)果顯示，褪黑激素的峰形和提取率無(wú)明顯變化，而維生素B6的峰形受甲醇比例的影響較大，當(dāng)甲醇比例超過(guò)10%時(shí)，其峰形不佳，褪黑激素很易溶于甲醇，加入少量甲醇即可將其從樣品中提取完全，同時(shí)又能保證維生素B6的峰形較好，故最終選擇以甲醇-水（10∶90）作為提取溶劑。

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（收稿日期：2016-09-26 本文編輯：李亞聰）