睪丸彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中MyD88及CD79B基因突變及意義

馬世榮，劉 楊，劉 芳，王映梅，王 哲，郭雙平

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是一種高度異質(zhì)性的淋巴瘤，包括不同的基因表達(dá)譜,基因異常以及不同的臨床表現(xiàn)和疾病預(yù)后[1]。睪丸原發(fā)性DLBCL以其獨(dú)特的臨床表現(xiàn)和分子特征不同于普通型DLBCL，睪丸原發(fā)性DLBCL是少見(jiàn)的高度侵襲性非霍奇金淋巴瘤，好發(fā)于60歲以上的老年男性[2-3]。根據(jù)分子分型分為生發(fā)中心B(germinal center B, GCB)細(xì)胞型及非生發(fā)中心B(non germinal center B, non-GCB)細(xì)胞型[4]。與GCB型DLBCL比較，non-GCB型具有預(yù)后不良及化療反應(yīng)差等特點(diǎn)，因此從腫瘤分子生物學(xué)及細(xì)胞遺傳學(xué)方面進(jìn)一步探尋腫瘤發(fā)生、發(fā)展及耐藥的機(jī)制，為DLBCL的治療提供新的治療靶點(diǎn)已經(jīng)成為目前研究的重點(diǎn)。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)non-GCB型DLBCL中存在NF-κB途徑的持續(xù)過(guò)度激活，NF-κB途徑的激活與其上游通路的B細(xì)胞受體(CD79B)及髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)的突變密切相關(guān)[5-6]。目前有文獻(xiàn)報(bào)道在原發(fā)于睪丸的DLBCL中MyD88及CD79B基因突變率高于發(fā)生在其他部位的DLBCL[7-10]。因此，本組實(shí)驗(yàn)針對(duì)MyD88、CD79B基因突變情況進(jìn)行分析，初步探討中國(guó)人睪丸原發(fā)性DLBCL的基因突變情況。

1 材料與方法

1.1一般資料收集2002年1月～2014年3月在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院診治的有完整臨床資料的15例睪丸原發(fā)性non-GCB型DLBCL患者，并進(jìn)行隨訪。所有病例均經(jīng)病理診斷確診，并根據(jù)Hans法分型。

1.2免疫組化及結(jié)果判讀手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，常規(guī)HE及免疫組化染色。所用抗體包括CD20、CD3、CD21、CD10、BCL-6、MUM1、Ki-67(Dako公司)，RelB、p52、p50和p65抗體(Abcam公司)，采用Ventana ultra View兩步法染色，用Roche Benchmark XT全自動(dòng)免疫組化染色儀進(jìn)行染色。CD3、CD20、CD21、CD10以胞膜呈彌漫性棕黃色顆粒為陽(yáng)性，BCL-6、MUM1、Ki-67以胞核內(nèi)見(jiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。其中CD10、BCL-6、MUM1的判讀，需>30%的腫瘤細(xì)胞表達(dá)抗體才可以評(píng)估為陽(yáng)性[4]。

1.3PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序制備5～10 μm厚的組織塊，使用QIAamp DNA FFPE試劑盒(QiagenValencia, CA, USA)提取基因組DNA。CD79B基因突變檢測(cè)應(yīng)用正向引物5′-TCTTGCAGAATGCACCTCAC-3′和反向引物5′-CAGGCCCTGGAGACATTAAG-3′對(duì)包含CD79B基因Y196位點(diǎn)編碼基因的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MyD88基因突變檢測(cè)應(yīng)用正向引物5′-TGCAGGGGTTGGTGTAGT-3′和反向引物5′-GTTGTTAACCCTGGGGTTG-3′對(duì)包含MyD88 L265位點(diǎn)編碼基因的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)15%瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物純化，由北京六合華大基因公司進(jìn)行測(cè)序儀測(cè)序(美國(guó)ABI公司，型號(hào)3730XL)，使用BioEdit軟件分析測(cè)序圖。

2 結(jié)果

2.1臨床特點(diǎn)本組15例睪丸原發(fā)性DLBCL患者發(fā)病年齡為26～86歲(平均為60.1歲)，>60歲者10例(占66.7%)。4例(占26.7%)為左側(cè)睪丸受累，9例(占60%)為右側(cè)睪丸受累，2例(占13.3%)為雙側(cè)睪丸受累(表1)。15例患者首發(fā)癥狀均為患側(cè)睪丸無(wú)痛性腫大，腫瘤局限于睪丸，就診時(shí)未累及淋巴結(jié)或睪丸外其他器官。

2.2病理組織學(xué)及免疫表型眼觀：腫瘤界限清楚，直徑1.5～8 cm，平均直徑為5.6 cm，切面灰白、灰黃色，實(shí)性，質(zhì)地中等。鏡檢：正常睪丸結(jié)構(gòu)被破壞，腫瘤性淋巴細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)，腫瘤細(xì)胞體積較大、中等量胞質(zhì)，細(xì)胞核呈圓形，細(xì)胞之間缺乏黏附性，呈彌漫浸潤(rùn)性生長(zhǎng)(圖1)。部分病例腫瘤細(xì)胞有單個(gè)大核仁位于細(xì)胞中心，呈免疫母細(xì)胞形態(tài)；部分病例腫瘤細(xì)胞核染色淡、呈空泡狀，有1個(gè)或多個(gè)靠近核膜的小核仁，呈中心母細(xì)胞形態(tài)；部分病例為混合型。免疫表型：15例睪丸原發(fā)性DLBCL腫瘤細(xì)胞均彌漫強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)B細(xì)胞標(biāo)志物CD20(圖2)，根據(jù)Hans法，即根據(jù)腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD10、BCL-6及MUM1的情況進(jìn)行分型，15例中CD10(圖3)及BCL-6(圖4)均陰性，MUM1陽(yáng)性(圖5)，結(jié)果15例均為non-GCB型。腫瘤細(xì)胞Ki-67增殖指數(shù)為34%～95%，Ki-67平均增殖指數(shù)為64%(圖6)。

2.3CD79B及MyD88基因突變的檢測(cè)及臨床病理分析本組15例中有8例檢測(cè)到CD79B基因點(diǎn)突變或MyD88基因點(diǎn)突變或2個(gè)基因同時(shí)點(diǎn)突變，占53.3%，其中7例存在MyD88 L265P點(diǎn)突變(圖7)，占46.7%；4例檢測(cè)到CD79B Y196 F點(diǎn)突變(圖8)，占26.7%。3例同時(shí)存在CD79B Y196 F及MyD88 L265P突變，占20%。未發(fā)現(xiàn)CD79B或MyD88基因點(diǎn)突變與患者年齡、部位、形態(tài)學(xué)分型之間的關(guān)系。

2.4治療及預(yù)后15例患者均行患側(cè)睪丸切除術(shù)，且術(shù)后按照CHOP或R-CHOP方案進(jìn)行化療。8例患者獲得隨訪資料，隨訪時(shí)間6～48個(gè)月，其中3例患者存活，5例患者死亡(表1)，未發(fā)現(xiàn)CD79B或MyD88基因突變與患者預(yù)后之間的聯(lián)系。

3 討論

睪丸原發(fā)性DLBCL非常少見(jiàn)，其預(yù)后差、具有特殊性，而non-GCB型DLBCL與GCB型相比其對(duì)化療的治療反應(yīng)及預(yù)后更差[11-12]，目前關(guān)于睪丸原發(fā)性non-GCB型DLBCL的研究較少，特別是缺乏靶向治療的靶點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道non-GCB型DLBCL具有較高的MyD88及CD79B的突變率[13-14]，因此針對(duì)這一現(xiàn)象，本組實(shí)驗(yàn)首次檢測(cè)了發(fā)生在中國(guó)人的15例睪丸原發(fā)性non-GCB型DLBCL的CD79B及MyD88基因突變，并探討其臨床病理特征與突變之間的關(guān)系及意義。

表1 15例睪丸原發(fā)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的臨床病理學(xué)特點(diǎn)

non-GCB:非生發(fā)中心B細(xì)胞型

①②③④⑤⑥

圖1腫瘤細(xì)胞體積較大，核圓形，細(xì)胞之間彼此缺乏黏附性，細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)2～3個(gè)小核仁，類似于中心母細(xì)胞圖2腫瘤細(xì)胞胞膜彌漫表達(dá)CD20，Ventana ultra View兩步法圖3腫瘤細(xì)胞CD10陰性，Ventana ultra View兩步法圖4腫瘤細(xì)胞BCL-6陰性，Ventana ultra View兩步法圖5腫瘤細(xì)胞胞核強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)MUM1，Ventana ultra View兩步法圖6腫瘤細(xì)胞Ki-67增殖活性為64%，Ventana ultra View兩步法

圖7A.睪丸原發(fā)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中MyD88基因L265位點(diǎn)未突變(對(duì)照組，CTG，Sanger測(cè)序)；B.睪丸原發(fā)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中MyD88基因L265P位點(diǎn)突變(檢測(cè)組，CTG>CCG，Sanger測(cè)序)

圖8A.睪丸原發(fā)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中CD79B基因Y196位點(diǎn)未突變(對(duì)照組，TAC，Sanger測(cè)序)；B.睪丸原發(fā)性彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中CD79B基因Y196 F位點(diǎn)突變(檢測(cè)組，TAC>TTC，Sanger測(cè)序)

3.1臨床特征睪丸原發(fā)性DLBCL是60歲以上老年人睪丸惡性腫瘤中最常見(jiàn)類型[15]，分子分型以non-GCB型為主[16]，本組15例睪丸原發(fā)性均為non-GCB型，患者年齡范圍為26～86歲，60歲以上患者占66.7%，與文獻(xiàn)報(bào)道相符合[17]。4例發(fā)生在左側(cè)睪丸，9例發(fā)生在右側(cè)睪丸，2例雙側(cè)睪丸受累，首發(fā)癥狀均為患側(cè)睪丸無(wú)痛性腫大，無(wú)睪丸外組織受累。

3.2MyD88基因突變檢測(cè)及意義MyD88基因是細(xì)胞質(zhì)里一種可溶性銜接蛋白，屬于Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)/白介素-1受體(interleukin-1 receptor, IL-1R)家族和死亡結(jié)構(gòu)域家族成員，介導(dǎo)多數(shù)TLR、IL-1R、白介素-18受體(interleukin-18 receptor, IL-18R)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)多種B細(xì)胞淋巴瘤，包括9%胃黏膜組織相關(guān)淋巴瘤、5%的伯基特淋巴瘤以及約29%的non-GCB型和6%的GCB型DLBCL中存在MyD88基因L265P位點(diǎn)突變[14,18]。這種功能活化型突變可引發(fā)IL-1R相關(guān)激酶介導(dǎo)的NF-κB、MAPK及JAK-STAT3信號(hào)途徑的持續(xù)激活、放大，促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖，逃脫細(xì)胞周期，抑制阻滯細(xì)胞分化成熟，導(dǎo)致腫瘤形成[19]。NF-κB通路的異?；罨莕on-GCB型DLBCL的重要特征，而抑制其活化對(duì)腫瘤的治療是一種潛在的治療途徑。有研究報(bào)道，來(lái)那度胺可以阻斷NF-κB通路的活化，且來(lái)那度胺可以通過(guò)增加干擾素β(IFNβ)殺死有MyD88基因突變的淋巴瘤細(xì)胞[20]。Kraan等[9]檢測(cè)了177例DLBCL患者M(jìn)yD88 L265P的突變情況，結(jié)果顯示，non-GCB型突變率為32.5%，且原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及睪丸DLBCL的突變率較高，分別達(dá)75%及71%，而原發(fā)淋巴結(jié)內(nèi)的DLBCL突變率僅17%。本組實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了15例睪丸原發(fā)性non-GCB型DLBCL中MyD88的突變，結(jié)果表明15例中有7例出現(xiàn)了MyD88的突變，占46.7%，與文獻(xiàn)報(bào)道的睪丸原發(fā)性non-GCB型DLBCL的MyD88突變率高相符合。因此，基于MyD88在睪丸原發(fā)性non-GCB型DLBCL中的高突變率，在部分由MyD88突變導(dǎo)致NF-κB通路活化進(jìn)而促進(jìn)DLBCL進(jìn)展的患者中，來(lái)那度胺的使用可以作為一種治療策略。

3.3CD79B基因突變檢測(cè)及意義CD79B是B細(xì)胞受體(BCR)近端銜接子，有研究表明在non-GCB型DLBCL中，NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活與慢性活動(dòng)性BCR信號(hào)激活后引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)有很大關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)non-GCB型DLBCL細(xì)胞株依賴BCR的功能表達(dá)，使用基因敲除技術(shù)抑制BCR復(fù)合體成分表達(dá)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組件時(shí)能有效殺死該細(xì)胞。其中BCR能引發(fā)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)生成的關(guān)鍵是免疫受體酪氨酸活化基序(TIAM)，它是在含CD79A和CD79B的BCR復(fù)合體中高度保守的多肽。約20%的non-GCB型DLBCL發(fā)生TIAM突變，其中CD79B的突變占21.1%，CD79A突變占2.9%，CD79B突變遠(yuǎn)高于CD79A的突變[6]。因此，本組15例non-GCB型DLBCL進(jìn)行了CD79B的Y196位點(diǎn)突變檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4例存在CD79B的Y196位點(diǎn)突變，占26.7%。這與文獻(xiàn)報(bào)道的21.1%的突變率相符合。

本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)具有CD79B的Y196位點(diǎn)突變的患者年齡與具有MyD88的L265位點(diǎn)突變的患者年齡差別不大，而同時(shí)具有CD79B的Y196位點(diǎn)和MyD88的L265位點(diǎn)突變的患者年齡明顯比具有單一突變的患者年齡大。具有單一或雙突變的睪丸原發(fā)性non-GCB型DLBCL患者年齡稍高于無(wú)突變的患者。由于獲得的隨訪資料有限，對(duì)于具有突變的睪丸原發(fā)性non-GCB型DLBCL患者的預(yù)后情況尚不明確。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，non-GCB型DLBCL中CD79B和MyD88突變對(duì)患者的生存情況無(wú)顯著影響[21]。但檢測(cè)腫瘤組織中CD79B及MyD88的突變情況，能為臨床的靶向治療提供更多依據(jù)。

總之，睪丸原發(fā)性non-GCB型DLBCL是一種少見(jiàn)的特殊類型的淋巴瘤，具有化療反應(yīng)差、預(yù)后不良等特點(diǎn)，診斷及治療均具有一定的困難，CD79B及MyD88在腫瘤中的高突變率可為腫瘤的分子靶向治療提供更有利的依據(jù)。

[1] Pasqualucci L. The genetic basis of diffuse large B-cell lymphoma[J]. Curr Opin Hematol, 2013,20(4):336-344.

[2] Vitolo U, Chiappella A, Ferreri A J,etal. First-line treatment for primary testicular diffuse large B-cell lymphoma with rituximab-CHOP, CNS prophylaxis, and contralateral testis irradiation: final results of an international phase II trial[J]. Clin Oncol, 2011,29(20):2766-2772.

[3] Gundrum J D, Mathiason M A, Moore D B,etal. Primary testicular diffuse large B-cell lymphoma: a population-based study on the incidence, natural history, and survival comparison with primary nodal counterpart before and after the introduction of rituximab[J]. J Clin Oncol, 2009,27(31):5227-5232.

[4] Hans C P, Weisenburger D D, Greiner T C,etal. Confirmation of the molecular classification of diffuse large B-cell lymphoma by immunohistochemistry using a tissue microarray[J]. Blood, 2004,103(1):275-282.

[5] Lim K H, Yang Y, Staudt L M. Pathogenetic importance and therapeutic implications of NF-kappa B in lymphoid malignancies[J]. Immunol Rev, 2012,246(1):359-378.

[6] Davis R E, Ngo V N, Lenz G,etal. Chronic active B-cell-receptor signalling in diffuse large B-cell lymphoma[J]. Nature, 2010,463(7277):88-92.

[7] Lee J H, Jeong H, Choi J W,etal. Clinicopathologic significance of MyD88 L265P mutation in diffuse large B-cell lymphoma: a meta-analysis[J]. Sci Rep, 2017,7(1):1785.

[8] Chapuy B, Roemer M G, Stewart C,etal. Targetable genetic features of primary testicular and primary central nervous system lymphomas[J]. Blood, 2016,127(7):869-881.

[9] Kraan W, Horlings H M, van Keimpema M,etal. High prevalence of oncogenic MyD88 and CD79B mutations in diffuse large B-cell lymphomas presenting at immune-privileged sites[J]. Blood Cancer J, 2013,3:e139.

[10] Kraan W, van Keimpema M, Horlings H M,etal. High prevalence of oncogenic MyD88 and CD79B mutations in primary testicular diffuse large B-cell lymphoma, Pals ST1[J]. Leukemia, 2014,28(3):719-720.

[11] Alizadeh A A, Eisen M B, Davis R E,etal. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling[J]. Nature, 2000,403(6769):503-511.

[12] Nowakowski G S, LaPlant B, Macon W R,etal. Lenalidomide combined with R-CHOP overcomes negative prognostic impact of non germinal center B cellpheno type in newly diagnosed diffuse large B cell lymphoma: a phaseⅡstudy[J]. J Clin Oncol, 2015,33(3):251-257.

[13] Taniguchi K, Takata K, Chuang S S,etal. Frequent MyD88 L265P and CD79B mutations in primary breast diffuse large B-cell lymphoma[J]. Am J Surg Pathol, 2016,40(3):324-334.

[14] Ngo V N, Young R M, Schmitz R,etal. Oncogenically active MyD88 mutations in human lymphoma[J]. Nature, 2011,470(7332):115-119.

[15] 劉 娟, 王曉卿, 徐 剛, 等. 睪丸原發(fā)性淋巴瘤17例臨床病理分析[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2016,32(6):626-629.

[16] Zucca E, Roggero E, Bertoni F,etal. Primary extranodal non-Hodgkin’s lymphomas. Part 1: gastrointestinal, cutaneous and genitourinary lymphomas[J]. Ann Oncol, 1997,8(8):727-737.

[17] 楊志蓉, 畢成峰, 張文燕, 等. 睪丸彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤58例臨床病理及免疫表型[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2013,42(9):589-592.

[18] Puente X S, Pinyol M, Quesada V,etal. Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in chronic lymphocytic leukaemia[J]. Nature, 2011, 475(7354):101-105.

[19] Jardin F. Next generation sequencing and the management of diffuse large B-cell lymphoma: from whole exome analysis to targeted therapy[J]. Discov Med, 2014,18(97):51-65.

[20] Yang Y, Shaffer A L, Emre N C,etal. Exploiting synthetic lethality for the therapy of ABC diffuse large B cell lymphoma[J]. Cancer Cell, 2012,21(6):723-737.

[21] Kim Y, Ju H, Kim D H,etal. CD79B and MyD88 mutations in diffuse large B-cell lymphoma[J]. Hum Pathol, 2014,45(3):556-564.