小分子化合物在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞領(lǐng)域的研究進(jìn)展

劉鑫洋，秦杰琛 綜述，趙慶 審校

1. 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650500；2. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南昆明 650500

過(guò)去人們認(rèn)為由于細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞基因組水平已經(jīng)發(fā)生了變化，因此干細(xì)胞經(jīng)歷成熟、分化為普通細(xì)胞這一過(guò)程被認(rèn)為是不可逆的。胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）來(lái)源于早期發(fā)育的胚胎，具有全能性及分化為任何類型細(xì)胞的可能，其通過(guò)分化為特定的細(xì)胞來(lái)治療疾病。但人ESCs 的應(yīng)用受到倫理學(xué)限制，因此直接獲取患者體細(xì)胞（somatic cells）通過(guò)小分子化合物誘導(dǎo)成有分化潛能的多能干細(xì)胞成為再生醫(yī)學(xué)的最終目標(biāo)［1］。2006 年，日本科學(xué)家篩選了24 種在小鼠早期胚胎和ESCs 中表達(dá)豐富的轉(zhuǎn)錄因子，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct-3 ／ 4、Sox2、Klf4 和c-Myc（“山中因子”O(jiān)SKM）導(dǎo)入分化的體細(xì)胞中，得到具有分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞，命名為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）［2］。iPSCs 的獲得不需要ESCs，也避免了核移植、細(xì)胞融合等技術(shù)帶來(lái)的倫理問(wèn)題。iPSCs 來(lái)源于自身的成體細(xì)胞，無(wú)免疫排斥反應(yīng)，在未來(lái)能夠成為細(xì)胞治療的理想細(xì)胞來(lái)源［3］。本文主要針對(duì)目前已經(jīng)報(bào)道的小分子化合物的分類、作用以及全化合物誘導(dǎo)獲取iPSCs的方法作一綜述。

1 細(xì)胞重編程及小分子化合物

隨著生物科學(xué)研究的深入，目前把已經(jīng)分化明確的細(xì)胞重新逆轉(zhuǎn)為具有多能性或全能性的細(xì)胞的方式，稱為細(xì)胞重編程（somatic cell reprogramming）或簡(jiǎn)稱為重編程（reprogramming）。目前，細(xì)胞重編程主要通過(guò)轉(zhuǎn)染特定的轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞核移植、細(xì)胞融合來(lái)實(shí)現(xiàn)［4］。重編程技術(shù)的誕生引起了生物醫(yī)學(xué)界的轟動(dòng)并被廣泛研究，但早期研究的細(xì)胞重編程涉及逆轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)，導(dǎo)入基因可能引起插入突變且轉(zhuǎn)換效率極低［5］。近年來(lái)研究人員發(fā)現(xiàn)了可以替代轉(zhuǎn)錄因子的小分子化合物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，也可以使已經(jīng)分化的細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為具有多能性的細(xì)胞。

小分子化合物可自由進(jìn)出細(xì)胞膜，相對(duì)分子質(zhì)量在幾十到幾百之間，通常由幾十個(gè)原子組成。目前有研究發(fā)現(xiàn)，小分子化合物的主要作用是通過(guò)探索基因與操控細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，來(lái)影響細(xì)胞內(nèi)特定的蛋白功能或者對(duì)某些蛋白家族的作用位點(diǎn)進(jìn)行特定的調(diào)節(jié)，其作用效果通常是可逆的；另外小分子化合物的濃度及作用時(shí)間也會(huì)影響其對(duì)基因和蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)［6］。在細(xì)胞重編程方面，小分子化合物相對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子的優(yōu)點(diǎn)還包括其性質(zhì)更加穩(wěn)定，購(gòu)買相對(duì)便宜，在實(shí)驗(yàn)室使用也比較簡(jiǎn)單。因此，小分子化合物在干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用日漸廣泛，使用其對(duì)誘導(dǎo)iPSCs 起促進(jìn)作用，從而提高重編程效率或完全替代相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，獲得更加安全有效的iPSCs。

2 小分子化合物的分類及作用

最早被發(fā)現(xiàn)對(duì)iPSCs 的誘導(dǎo)起促進(jìn)作用的化合物為一種組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑丙戊酸（valproicacid，VPA），組蛋白乙?；墒辜?xì)胞染色體松散，提高細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性，易于與外源性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，最終提高細(xì)胞重編程效率。目前已發(fā)現(xiàn)的同屬HDAC 抑制劑的小分子化合物還包括苯丁酸鈉（sodium phenylbutyrate，SPB）、曲古抑菌素A（trichostatin，TSA）和Butyrate［7-8］。成纖維細(xì)胞在重編程過(guò)程中會(huì)發(fā)生間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET），與常見(jiàn)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）過(guò)程剛好相反。MET 過(guò)程由外源性重編程轉(zhuǎn)錄因子引發(fā)，其中TGF-β（transforming growth factor-β）信號(hào)通路是MET 所必需的信號(hào)通路。目前研究發(fā)現(xiàn)，一些TGF-β 信號(hào)通路的抑制劑可促進(jìn)EMT 進(jìn)程，使重編程的效率提高，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可促進(jìn)細(xì)胞重編程的TGF-β 信號(hào)通路的抑制劑包括repsox（E-616452）、A-83-01、SB431542 和LY-364947［9-10］。有研究者在使人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加ROCK（Rhokinase）通路激酶抑制劑Y27632、Thiazovivin 及維生素C，可顯著提高細(xì)胞的重編程效率及存活率［11］。cAMP（cyclic adenosine monophosphate）激活劑forskolin、IBMX、Rolipram 和8-Br-cAMP 也可在細(xì)胞新陳代謝上發(fā)揮作用，與VPA 結(jié)合使用，可促進(jìn)新生兒成纖維細(xì)胞重編程，并提高重編程效率6. 5 倍［12］。此外，人們熟知的Wnt（wingless ／ integrated）信號(hào)通路在維持ESCs多能性上也發(fā)揮關(guān)鍵作用［13］。GSK（glycogen synthase kinase）-Wnt 信號(hào)通路抑制劑CHIR99021、BIO和Kenpaullone 通過(guò)抑制糖原合成激酶（GSK-β），促進(jìn)多能干細(xì)胞的自我更新，從而達(dá)到提高iPSCs 重編程效率的目的，CHIR99021 也能在僅有Oct4 和Klf4 兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的情況下，成功將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）進(jìn)行重編程［14］。

近年來(lái)，通過(guò)運(yùn)用包含了信號(hào)通路抑制劑［2i ／LIF（2i：PD0325901）、MAPK（mitogen-activated protein kinase）、ERK（extracellular signal-regulated linase）］-白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）的培養(yǎng)體系來(lái)培養(yǎng)豬、小鼠及人多能干細(xì)胞，可建立穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系，其中PD0325901 作為MAPK／ERK信號(hào)通路抑制劑的主要作用是維持多能干細(xì)胞的多能狀態(tài)［15-16］。因此，2i ／ LIF 培養(yǎng)體系可維持iPSCs的多能性并使其增殖。也有研究將一種TGF-β 信號(hào)通路抑制劑SB431542 加入至上述培養(yǎng)體系中，顯著提高了小鼠ESCs 的建系效率［17］。目前發(fā)現(xiàn)的小分子還包括一系列組蛋白相關(guān)化合物，如組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（histone methyltransferase）抑制劑（BIX-0129、Hydralazine、AMI-5、Parnate 和DZNep）及組蛋白去甲基化酶（histone demethylase）抑制劑Tranylcypromine［18-19］。還發(fā)現(xiàn)一種L 型鈣離子通道興奮劑BayK8644，與BIX-01294 共同作用可提高Oct4 和Klf4 對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞的重編程效率，彌補(bǔ)Sox2 缺失帶來(lái)的影響［20］。另有研究表明，氧化磷酸化向糖酵解的過(guò)渡是iPSCs 重編程的關(guān)鍵步驟，2，6-二磷酸果糖、2，4-二硝基酚、槲皮素等化合物能激活糖酵解抑制線粒體氧化磷酸化，也可提高細(xì)胞重編程效率［21-23］。目前已經(jīng)報(bào)道的小分子化合物及其具體分類見(jiàn)表1。

表1 小分子化合物及其具體分類Tab. 1 Small molecule compounds and their classification

3 全化合物誘導(dǎo)iPSCs

在四因子誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上，添加小分子化合物可提高重編程效率，但由于Klf4 和c-Myc 兩個(gè)原癌基因的存在，同時(shí)用逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體導(dǎo)入基因可能引起插入突變，使獲取iPSCs 這一過(guò)程的安全性仍需觀察。因此，完全使用小分子化合物替代轉(zhuǎn)錄因子從而更加安全地獲取iPSCs 就具有了較大的研究?jī)r(jià)值。通過(guò)使用不同化合物的組合，發(fā)現(xiàn)VPA、CHIR-99021、Repsox［E-Repsox（E-616452）］和Tranylcypromine 與Oct4 一因子組合可實(shí)現(xiàn)重編程，誘導(dǎo)iPSCs的轉(zhuǎn)錄因子由最早的4 因子減少為Oct41 因子［29］。又有研究者使用MEFs 細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和脂肪來(lái)源干細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM ／ 高糖中培養(yǎng)。經(jīng)歷了3 個(gè)試驗(yàn)階段并且使用了VPA、CHIR-99021、Repsox（E-616452）、Tranylcypromine、Forskolin、TTNPB 和DZNep（VC6TFDT）七種小分子化合物，最終獲得了化學(xué)誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（chemical induced pluripotent stem cells，簡(jiǎn)稱CiPSC）。目標(biāo)細(xì)胞形態(tài)特征、基因表達(dá)譜、分化能力和嵌合體形成能力均與ESC 相似，重編程的效率達(dá)0. 2%。通過(guò)小分子化合物組合篩選及優(yōu)化，僅用其中的4 種小分子CHIR99021、Repsox（E-616452）、Forskolin 和DZNep也能完成體細(xì)胞重編程，其中CHIR99021、Repsox（E-616452）和Forskolin 能激活Sall4、Sox2 的表達(dá)，而DZNep 能激活Oct4 的表達(dá)［24-30］。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在化學(xué)重編程過(guò)程中存在Somatic-XEN-CiPSC 的過(guò)程，其過(guò)渡態(tài)類似于胚外內(nèi)胚層（extraembryonic endoderm，XEN）細(xì)胞，在VC6TFDT 的基礎(chǔ)上添加了維甲酸（retinoic acid，RA）受體激動(dòng)劑AM580 和組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（histone lysine-specific methyltransferases，KMTs）抑制劑EPZ-004777，使體細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閄EN 細(xì)胞，又加入DOT1L抑制劑SGC0946，誘導(dǎo)細(xì)胞完成XEN-CiPSC 轉(zhuǎn)化，同時(shí)使用PD0325901 和CHIR99021 維持CiPSC 細(xì)胞的多能性，最后通過(guò)調(diào)節(jié)小分子化合物的濃度，使小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞及小腸上皮細(xì)胞誘導(dǎo)成iPSCs［25-31］，在未來(lái)通過(guò)找到化合物誘導(dǎo)重編程的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，可能更加安全高效地獲取iPSCs。有研究表明，生物學(xué)診斷試劑5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）通過(guò)降低細(xì)胞DNA 甲基化水平從而對(duì)重編程起到促進(jìn)作用，其與四因子、三因子或兩因子合用能提高誘導(dǎo)效率。Brdu 不但能提高誘導(dǎo)效率，與CHIR99021、Repsox（E-616452）以及與Forskolin 也均能產(chǎn)生iPSCs，獲得的iPSCs 在體內(nèi)外具有自我更新及分化能力，用于試驗(yàn)的小鼠存活長(zhǎng)達(dá)6 個(gè)月，且證實(shí)不會(huì)導(dǎo)致基因突變［32］。

還有其他研究表明，在低氧條件下，使用三種小分子化合物VPA、CHIR99021 和Repsox（E-616452）可以分別將MEF 細(xì)胞、小鼠尾尖成纖維細(xì)胞（mouse tail-tip fibroblasts，TTFs）和人尿液細(xì)胞（human urinary cells，HUCs）重編程為化學(xué)誘導(dǎo)型神經(jīng)前體細(xì)胞（chemical-induced neuralprogenitor cells，ciNPCs），進(jìn)一步證明了利用Forskolin、Y-27632、JNK（c-Jun N-terminal kinase）抑制劑SP600125 以及PKC（protein kinase C）抑制劑GO6983，在一定程度上直接將正常人或阿爾茲海默病患者的成纖維細(xì)胞重編程為化學(xué)誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞（human chemical-induced neuronal cells，hciNs）。這種hciNs 細(xì)胞與利用hiPS 細(xì)胞誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)元細(xì)胞在形態(tài)、基因表達(dá)譜和電生理學(xué)特性上一致，且縮短了重編程的時(shí)間進(jìn)程，獲得的細(xì)胞也更加安全［26-27］。

近年來(lái)的研究表明，在VPA、CHIR99021 和Repsox（E-616452）三種化合物的基礎(chǔ)上，加入Forskolin 和I-BET151，可將人類成年星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程為神經(jīng)元細(xì)胞，這種小分子化合物的組合方式也能誘導(dǎo)人類肝細(xì)胞重編程為雙能祖細(xì)胞［33-35］。2017年，LAI 等［36］使用了SP600125、SB202190、Go6983、Y-27632、PD0325901 和CHIR99021 六種化合物，通過(guò)化學(xué)混合物的誘導(dǎo)方式從人真皮成纖維細(xì)胞中有效地獲得化學(xué)誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞，轉(zhuǎn)化率約為38%。同時(shí)六種化學(xué)物質(zhì)中有任何一種缺失均會(huì)降低重編程效率，且在小分子化合物誘導(dǎo)體系中，重編程時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)和血清使用均可能影響重編程機(jī)制。之后又有研究人員使用CHIR99021、PD0325901、SB-431-542、BMP（bone morphogenetic protein）信號(hào)通路抑制劑LDN-193189、P53 抑制劑Pifithrin-α 和Forskolin，將人成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為褐色脂肪細(xì)胞［28］。在全化合物誘導(dǎo)細(xì)胞重編程方面，對(duì)于重編程進(jìn)程或多種化合物組合使用的研究，已經(jīng)越來(lái)越深入和具體，在未來(lái)更有利于iPSCs 的臨床應(yīng)用。

4 展 望

自2006 年iPSCs 首次被報(bào)道后，化合物誘導(dǎo)細(xì)胞重編程已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。但細(xì)胞通過(guò)化合物重編程的分子機(jī)制目前尚不完全明確，其誘導(dǎo)效率也仍需提高，還需尋找更多小分子組合誘導(dǎo)其他類型細(xì)胞重編程。相比傳統(tǒng)的基因操作方式，化合物誘導(dǎo)細(xì)胞重編程更加方便且安全，隨著未來(lái)研究的深入，這項(xiàng)技術(shù)將在再生醫(yī)學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景，我們期望能早日獲得可供臨床運(yùn)用的誘導(dǎo)型細(xì)胞。