基于系統(tǒng)藥理學(xué)方法研究頭痛寧膠囊治療偏頭痛的TNF機(jī)制

聶西周+杜霞+張瑞瑞+何娟+蘇瑞+馬虎強(qiáng)+穆珺+李曄+劉峰

[摘要]頭痛寧膠囊是一種臨床上治療偏頭痛的中藥制劑，療效確切。該研究采用系統(tǒng)藥理學(xué)方法對(duì)頭痛寧膠囊治療偏頭痛的藥效成分及TNF機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。首先，從數(shù)據(jù)庫中收集頭痛寧膠囊單味藥材所含化學(xué)成分，首次采用ADME性質(zhì)預(yù)測(cè)初篩頭痛寧膠囊的活性成分，然后利用CSDT模型進(jìn)行靶標(biāo)的搜尋和識(shí)別，并通過TTD等常見數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)映射在偏頭痛疾病上來確定作用靶標(biāo)。通過DAVID在線分析工具對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行KEGG通路分析獲得與TNF機(jī)制相關(guān)的靶標(biāo)。最后，采用Cytoscape軟件構(gòu)建“藥材-成分-靶標(biāo)”之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，通過度值和介數(shù)中心度的分析，確定TNF通路中的關(guān)鍵藥效成分及靶標(biāo)，并對(duì)該作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。結(jié)果表明，頭痛寧膠囊中19個(gè)化合物與8個(gè)靶標(biāo)在治療偏頭痛的TNF通路中起著至關(guān)重要的作用。該研究為頭痛寧膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提供了一種新的研究策略，為該制劑藥效標(biāo)志物的確定及臨床研究提供了必要的理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]偏頭痛； 頭痛寧膠囊； 系統(tǒng)藥理學(xué)； 腫瘤壞死因子信號(hào)通路

[Abstract]Toutongning capsule （TTNC） is a traditional Chinese medicine（TCM） with good effect for treating migraine in clinical application. In this paper， a systems pharmacology method was carried out to study the TNF mechanism of the TTNC on the migraine. First， the ingredients for TTNC were collected from TCM databases， and ADME properties prediction was firstly applied to screen out the active compounds of TTNC. Then， the target searching and identification was performed by using CSDT model， and the targets were mapped to the migraine disease to determine the active targets through some common databases like TTD. To obtain the targets related with TNF signaling pathway， KEGG pathway analysis was performed by DAVID online analysis tool. Finally， the "herbs-compounds-targets" network was built by Cytoscape software. According to the results of degree and betweenness in the network， the key active compounds and targets were determined to explore the TNF mechanism for TTNC. Results showed that 19 active compounds and 8 targets played a crucial role in the treatment of migraine by TNF pathway for TTNC. This work provided a new perspective to deepen the understanding of the TNF signaling pathway mechanism in migraine treatment by TTNC， and may provide a necessary theoretical basis for the determination of effective markers and the clinical research of this medicine.

[Key words]migraine； Toutongning capsule； systems pharmacology； TNF signaling pathway

偏頭痛（migraine）是一種常見的慢性和陣發(fā)性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，有單側(cè)或雙側(cè)、搏動(dòng)性發(fā)生的特點(diǎn)，常伴有惡心、嘔吐、畏聲、畏光等癥狀。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，全球每年有2.4億人發(fā)作偏頭痛，造成的年直接經(jīng)濟(jì)費(fèi)用高達(dá)580億，是困擾人類健康的常見疾病之一^[1]。近年來，雖然國(guó)內(nèi)外已有很多針對(duì)偏頭痛的診斷指南并對(duì)其防治起到了一定的作用，諸如普奈洛爾和美托洛爾等化藥被認(rèn)為是臨床上的一線用藥。但事實(shí)上偏頭痛的預(yù)防用藥情況并不如預(yù)想的那么樂觀，其服藥周期長(zhǎng)常常會(huì)帶來諸多不良反應(yīng)，諸如嗜睡、疲倦乏力、焦慮抑郁、肌肉酸痛、溢乳等副作用，都影響或限制了其應(yīng)用。

中醫(yī)學(xué)對(duì)偏頭痛的認(rèn)識(shí)早在《內(nèi)經(jīng)》中就有記載，有“首風(fēng)”、“腦風(fēng)”之稱?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，偏頭痛的發(fā)病機(jī)制有神經(jīng)學(xué)說和血管源學(xué)說，同時(shí)，TNF通路也備受關(guān)注，偏頭痛患者TNF明顯偏高，認(rèn)為是其發(fā)病及其治療的一條重要通路^[2]。研究表明，中藥防治偏頭痛不良反應(yīng)相對(duì)較少，有較好的應(yīng)用前景^[3-4]。頭痛寧膠囊是由陜西步長(zhǎng)制藥研發(fā)生產(chǎn)的中藥復(fù)方制劑，由土茯苓、天麻、制何首烏、當(dāng)歸、防風(fēng)、全蝎6味藥材加工而成，具有熄風(fēng)滌痰、逐瘀止痛之功效，臨床主要用于偏頭痛的治療，且療效顯著，未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)和藥物依賴性^[5-7]。目前，大多的研究集中在通過臨床療效探討其治療偏頭痛的作用機(jī)制，對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子作用機(jī)制的研究尚不明確。因此，從分子水平識(shí)別藥效成分和作用靶點(diǎn)，對(duì)于闡述整個(gè)復(fù)方的作用機(jī)制具有重要的意義。

系統(tǒng)藥理學(xué)是從分子、細(xì)胞到組織、器官等不同水平上建立藥物對(duì)于機(jī)體的作用，從微觀到宏觀的各個(gè)水平間相互關(guān)聯(lián)的新方法^[8]。該方法的出現(xiàn)為中藥復(fù)方的研究帶來了新的研究思路。目前，該方法已經(jīng)成功運(yùn)用于中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論“君臣佐使”和“相須”的解析、對(duì)中藥及其復(fù)方的作用機(jī)制的研究、經(jīng)方驗(yàn)方的優(yōu)化及新藥研發(fā)等方面^[9]。本研究基于系統(tǒng)藥理學(xué)方法，利用ADME性質(zhì)篩選、靶標(biāo)的識(shí)別、KEGG通路分析及網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和拓?fù)湫再|(zhì)分析等手段，對(duì)頭痛寧膠囊治療偏頭痛的藥效成分及作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)地探究，為臨床研究提供必要的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 頭痛寧膠囊中藥材成分收集 頭痛寧膠囊是由土茯苓、天麻、制何首烏、當(dāng)歸、防風(fēng)和全蝎6味中藥組成的復(fù)方制劑。依托西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)院創(chuàng)建的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）、中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所建立的化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫、中國(guó)臺(tái)灣中醫(yī)藥大學(xué)建立的TCM Database@Taiwan數(shù)據(jù)庫及美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)圖書館提供的PubMed數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)挖掘，對(duì)頭痛寧膠囊中藥材的化學(xué)成分進(jìn)行了匯總，并建立頭痛寧膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。

1.2 ADME篩選 近年來，隨著計(jì)算化學(xué)和統(tǒng)計(jì)力學(xué)的快速發(fā)展，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中獲得的大量ADME數(shù)據(jù)建立合理的計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)模型，用于高通量的虛擬篩選，從而對(duì)化合物進(jìn)行“早期評(píng)價(jià)、早期淘汰”已經(jīng)成為新藥研發(fā)的重要策略之一。本研究將ADME性質(zhì)預(yù)測(cè)引入到對(duì)頭痛寧膠囊藥效成分的初篩中，采用王永華等^[10]建立的Obioavail 1.1，preCaco2和基于最小二乘判別法的BBB預(yù)測(cè)模型對(duì)所有成分的OB（口服利用度），Caco-2，BBB（血腦屏障透過性）進(jìn)行計(jì)算并初篩藥效成分，閾值設(shè)定采用文獻(xiàn)報(bào)道的OB≥30%，Caco-2≥-0.40和BBB≥-0.30^[8-9]。

1.3 靶標(biāo)識(shí)別 本研究采用了一種基于隨機(jī)森林（random forests，RF）和支持向量機(jī)（support vector machine，SVM）算法的CSDT（cross-species drug-target）模型進(jìn)行靶點(diǎn)的搜尋和識(shí)別工作。該模型的訓(xùn)練集包括Drugbank數(shù)據(jù)庫中6 511個(gè)藥物分子和近4 000個(gè)與已知藥物分子作用的蛋白質(zhì)，且結(jié)果顯示該模型的預(yù)測(cè)性能和諧性達(dá)到82.83%，敏感性為81.33%，特異性為93.62%，模型可靠。然后，借鑒UniProt（Universal Protein，UniProt）在線資源獲得所有靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因信息。通過查找TTD數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database，TTD）、CTD數(shù)據(jù)庫（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）和PharmGKB（Pharmacogenomics Knowledgebase，PharmGKB）將靶點(diǎn)映射于相應(yīng)的疾病上，即可進(jìn)一步獲得頭痛寧膠囊治療偏頭痛疾病的藥效成分及其對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)和基因信息。

1.4 KEGG信號(hào)通路分析 DAVID（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）是一種可以直觀觀測(cè)到基因的富集通路、目標(biāo)基因?qū)?yīng)的蛋白及其相互關(guān)系的在線分析工具。本研究采用DAVID對(duì)頭痛寧膠囊作用靶標(biāo)進(jìn)行KEGG分析，從而確定TNF通路相關(guān)的藥效化合物及靶標(biāo)，以便進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析。

1.5 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 采用Cytoscape 3.4軟件構(gòu)建藥材-成分-靶標(biāo)的相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中，藥材、成分和靶標(biāo)用節(jié)點(diǎn)（node）表示，節(jié)點(diǎn)之間的相互作用用邊（edge）表示。然后，利用Cytoscape軟件中的NetworkAalyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)：度（degree）和介數(shù)中心度（betweenness），度和介數(shù)中心度越高，該化合物或靶標(biāo)在網(wǎng)絡(luò)中越重要，是網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵樞紐，在治療疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。

2 結(jié)果和討論

2.1 頭痛寧膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫 頭痛寧膠囊全方中含動(dòng)物藥全蝎，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明^[11]，全蝎主要活性成分為蝎毒素，是一種活性多肽，由20～70個(gè)氨基酸組成，具有鎮(zhèn)痛的藥理活性，有關(guān)蝎毒素鎮(zhèn)痛機(jī)制的研究已有報(bào)道^[12]。然而，對(duì)于方中5味植物藥，未見具體成分的機(jī)制報(bào)道。本研究采用數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)搜集確定了5種植物藥中所含的410種化學(xué)成分。其中，當(dāng)歸含125種，土茯苓含74種，防風(fēng)含173種，天麻含16種，制何首烏含22種。這些化合物中，胡蘿卜苷、β-谷甾醇和棕櫚酸等5種化合物既存在于當(dāng)歸，也存在于土茯苓，白藜蘆醇和棕櫚酸等5種成分共同存在于土茯苓和制何首烏，當(dāng)歸和防風(fēng)的共有易揮發(fā)性成分5種。這些化學(xué)成分多為黃酮、有機(jī)酸和酯類，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道^[13-15]，黃酮類成分確有鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)和抗炎調(diào)節(jié)免疫的藥理作用，有機(jī)酸和酯類成分在抗血小板凝集、抗炎、止痛、抗氧化等方面的藥理活性也已經(jīng)得到證實(shí)。

2.2 ADME篩選 采用王永華等^[10]建立的ADME篩選模型獲得上述410種化合物的OB，Caco-2和BBB值，通過篩選獲得159個(gè)ADME性質(zhì)較好的化合物用于后續(xù)研究。這些化合物大多為酚酸酯類和黃酮類化合物，例如：藁本內(nèi)酯（MOL002201，OB=51.30%，Caco-2=1.30，BBB=1.24）、香草醛（MOL000635，OB=52.00%，Caco-2=0.68，BBB=0.41）、香草酸（MOL000114，OB=35.47%，Caco-2=0.43，BBB=0.09）、川白芷內(nèi)酯（MOL011732，OB=59.65%，Caco-2=0.56，BBB=-0.02）、紫花前胡素（MOL013077，OB=39.27%，Caco-2=0.77，BBB=0.25）、人參炔醇（MOL001949，OB=42.44%，Caco-2=1.52，BBB=1.03）和珊瑚菜素（MOL011749，OB=43.39%，Caco-2=0.90，BBB=0.43）；黃酮類成分如：漢黃芩素（MOL000173，OB=30.68%，Caco-2=0.79，BBB=0.04）。這些化合物中部分化合物已被證明在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病有較好的藥理學(xué)活性。例如：當(dāng)歸中的藁本內(nèi)酯具有鎮(zhèn)痛、抗炎、舒張血管的藥理作用^[16-17]，防風(fēng)中的人參炔醇既對(duì)缺血性損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用，也對(duì)神經(jīng)具有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用^[18]。除此之外，白藜蘆醇（MOL012744，OB=19.07%，Caco-2=0.80，BBB=-0.01）、云杉新苷（MOL000105，OB=21.44%，Caco-2=-0.90，BBB=-1.81）、落新婦苷（MOL004575，OB=36.46%，Caco-2=-1.29，BBB=-1.85）、新落新婦苷（MOL013118，OB=40.54%，Caco-2=-1.07，BBB=-1.57）、花旗松素（MOL004576，OB=57.84%，Caco-2=-0.23，BBB=-0.80）和天麻素（MOL007986，OB=8.19%，Caco-2=-1.33，BBB=-2.29）的ADME性質(zhì)較低，但這些化合物已被證明在鎮(zhèn)痛、心血管神經(jīng)系統(tǒng)具有較好的藥理活性。天麻素具有明顯的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗衰老等藥理活性^[19]，落新婦苷、新落新婦苷在心血管神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用明顯^[20]，而云杉新苷、花旗松素和白藜蘆醇在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛抗炎作用也具有較為明顯藥理學(xué)特征^[20-22]。因此，最終確定165個(gè)化合物作為潛在的藥效成分用于后續(xù)的研究。

2.3 靶標(biāo)的識(shí)別 采用CSDT模型進(jìn)行靶標(biāo)的識(shí)別，并將所有靶點(diǎn)映射到疾病基因數(shù)據(jù)庫中，對(duì)潛在藥效成分和靶點(diǎn)、基因進(jìn)行二次篩選，最終獲得120個(gè)化合物和與之對(duì)應(yīng)的482個(gè)靶標(biāo)（去重后得45個(gè)靶點(diǎn)）。

2.4 KEGG信號(hào)通路分析 圖1為頭痛寧膠囊的所有靶標(biāo)的KEGG通路分析結(jié)果。從圖中可以看出，頭痛寧膠囊治療偏頭痛的通路主要有鈣信號(hào)、NF-κB，cAMP以及TNF等16種通路，其中，與TNF通路相關(guān)聯(lián)的靶標(biāo)有8個(gè)，與之對(duì)應(yīng)的藥效化合物高達(dá)106個(gè)，且與5種藥材均有關(guān)聯(lián)，是所有通路中與疾病相關(guān)的藥效成分及靶標(biāo)數(shù)最多的通路之一，因此，該通路可能為頭痛寧膠囊治療偏頭痛的重要通路之一。

2.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及TNF通路分析 圖2為與TNF通路相關(guān)的藥材、藥材的藥效成分和與之對(duì)應(yīng)的8個(gè)靶標(biāo)相連構(gòu)建H-C-T網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。網(wǎng)絡(luò)中包含103個(gè)節(jié)點(diǎn)（含5個(gè)藥材、106個(gè)化合物和8個(gè)靶標(biāo)）和252條邊。圖中，綠色圓形節(jié)點(diǎn)代表藥材，紫色三角形節(jié)點(diǎn)代表藥效化合物，藍(lán)色圓角矩形節(jié)點(diǎn)代表藥物靶標(biāo)，每條邊代表不同節(jié)點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。采用網(wǎng)絡(luò)分析獲得網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的拓?fù)湫再|(zhì)——度（degree）和介數(shù)中心度（betweenness），根據(jù)度值和介數(shù)中心度值判斷頭痛寧膠囊通過TNF通路治療偏頭痛的關(guān)鍵成分和靶標(biāo)。最終，獲得19個(gè)在TNF通路中起重要作用的化合物和8個(gè)靶標(biāo)，見表1，2。其中，白藜蘆醇（resveratrol，degree=16，betweenness=0.083 5）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，degree=12，betweenness=0.004 9）、香草醛（vanillin，degree=10，betweenness=0.014 7）和漢黃芩素（wogonin，degree=10，betweenness=0.034 5）表現(xiàn)出較高的度和介數(shù)中心度值，這些成分在治療偏頭痛的TNF通路中至關(guān)重要。例如：白藜蘆醇可顯著抑制TNFR1的表達(dá)，進(jìn)而抑制TNF-α刺激引起的炎癥因子的釋放，減輕內(nèi)皮炎癥^[23]，而漢黃芩素具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫作用的活性，能夠抑制 NF-κB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)TRAIL 誘導(dǎo)的凋亡的作用^[24]。

偏頭痛是一種神經(jīng)血管疾病，TNF通路是偏頭痛發(fā)病機(jī)制的重要通路，圖3為TNF作用通路圖，圖中紅色代表與頭痛寧膠囊相關(guān)的8個(gè)靶標(biāo)。這8個(gè)靶標(biāo)中前列腺素G/H合成酶2（PTGS2，degree=101，betweenness=0.793 5）表現(xiàn)出特別高的度和介數(shù)中心度值，是TNF通路中的關(guān)鍵靶標(biāo)，PTGS2基因是前列腺素的生物合成的核心酶，腦血管收縮是偏頭痛前驅(qū)期的特征，而頭痛發(fā)作時(shí)腦血管擴(kuò)張呈特征性變化，PTGS2則是被認(rèn)為的偏頭痛的致痛因子之一^[25]。另據(jù)黃銀蘭等^[26]報(bào)道利用本經(jīng)取穴可調(diào)控PTGS2基因表達(dá)從而治療偏頭痛，這也說明PTGS2與偏頭痛有著密切的聯(lián)系，但是目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道PTGS2治療偏頭痛的作用機(jī)制。此外，轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA，degree=6，betweenness=0.021 3）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN，degree=8，betweenness=0.004 3）和腫瘤壞死因子（TNF，degree=4，betweenness=0.007 1）也是該通路的主要靶標(biāo)，與偏頭痛的作用機(jī)制密切相關(guān)。ICAM1，IL6這2種基因在偏頭痛的病變過程中可起到的誘導(dǎo)作用^[27]，兩者存在相互關(guān)系并參與偏頭痛機(jī)制的發(fā)生，而NF-κB在偏頭痛的發(fā)病機(jī)制中，可增加FOS表達(dá)的作用，從而參與偏頭痛的發(fā)生^[28]。MMP9則是參與炎癥反應(yīng)病理生理過程的一種重要物質(zhì)，有研究表明^[29]，MMP9可參與了偏頭痛的病理生理過程。TNF因子在調(diào)節(jié)免疫功能的同時(shí)，過量可造成對(duì)組織的損傷^[30]，參與偏頭痛的發(fā)生。因此，頭痛寧膠囊呈現(xiàn)出的多分子、多靶點(diǎn)協(xié)同作用優(yōu)勢(shì)明顯，主要活性成分可參與TNF通路的調(diào)節(jié)作用，對(duì)偏頭痛發(fā)病機(jī)制各環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)，從而達(dá)到治療偏頭痛的目的。

此外，從結(jié)果中還可以看出，同一種藥物成分往往作用于多個(gè)靶標(biāo)，每個(gè)靶標(biāo)至少與2個(gè)以上的化合物相聯(lián)系，例如：白藜蘆醇為制何首烏藥效成分，與8個(gè)靶標(biāo)均有作用，β-谷甾醇是防風(fēng)所含化合物，作用于PTGS2，IL6，JUN，RELA和TNF這5個(gè)靶標(biāo)，當(dāng)歸中的香蘭素和漢黃芩素分別作用于2個(gè)（PTGS2和JUN）和3個(gè)靶標(biāo)（PTGS2，JUN和MMP9），這些結(jié)果也體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶標(biāo)的作用特點(diǎn)。

3 結(jié)論

本研究采用系統(tǒng)藥理學(xué)方法對(duì)頭痛寧膠囊治療偏頭痛的TNF通路進(jìn)行研究，通過ADME預(yù)測(cè)、靶標(biāo)識(shí)別、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析，從“藥物-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)聯(lián)性對(duì)頭痛寧膠囊治療偏頭痛的相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行分析，能夠作用于偏頭痛相關(guān)的TNF通路中8個(gè)靶標(biāo)為關(guān)鍵作用靶標(biāo)，19個(gè)化合物為潛在關(guān)鍵活性成分，為頭痛寧膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提供了一種新的研究策略，為該制劑藥效標(biāo)志物的確定及臨床研究提供了必要的理論依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]