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    維醫(yī)異常黑膽質(zhì)型COPD大鼠模型肺組織和膈肌的超微結(jié)構(gòu)觀察

    2017-03-20 22:50:09高振王晶徐丹荊晶李爭(zhēng)
    關(guān)鍵詞:超微結(jié)構(gòu)慢性阻塞性肺疾病

    高振++王晶++徐丹++荊晶++李爭(zhēng)++姜敏++哈木拉提·吾甫爾++李風(fēng)森

    【摘要】目的:電鏡觀察研究異常黑膽質(zhì)型COPD大鼠肺組織和膈肌組織的病理改變。方法:利用氣道滴注彈性蛋白酶結(jié)合熏煙90d基礎(chǔ)上疊加干寒環(huán)境、干寒飲食和足底電刺激建立異常黑膽質(zhì)型COPD模型(ASSCOPD)。取肺組織和膈肌組織進(jìn)行電鏡觀察。結(jié)果:對(duì)照組肺泡壁完整、肺泡清晰,肺泡Ⅱ型細(xì)胞有板層小體正常;膈肌纖維肌節(jié)排列整齊,肌膜下線粒體排列相對(duì)整齊。ASSCOPD肺泡腔內(nèi)有巨噬細(xì)胞,溶酶體增多;出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu);線粒體腫脹、基質(zhì)密度降低,排列較為松散。ASSCOPD膈肌細(xì)胞異常收縮帶、局部肌絲、肌原纖維溶解,線粒體腫脹,出現(xiàn)磚墻樣改變。結(jié)論:異常黑膽質(zhì)型COPD屬于中重度COPD范疇,其不僅存在肺部的超微病理結(jié)構(gòu)改變,而且膈肌的結(jié)構(gòu)改變也較為明顯,可能是異常黑膽質(zhì)型COPD的主要病理變化之一。

    【關(guān)鍵詞】慢性阻塞性肺疾??;異常黑膽質(zhì)型;超微結(jié)構(gòu);肺;膈肌

    【中圖分類號(hào)】R563【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517(2017)04-0033-05

    Ultrastructural Morphological Study of Pulmonary Tissue and Diaphragm of Abnormal Savda

    Syndrome of Chronic Obstructive Pulmonary DiseaseGAO Zhen1,2,3WANG Jing3XU Dan1JING Jing1LI Zheng1JIANG Min3Halmurat Upur1*LI Fengsen1,3

    1. National Clinical Research Base of Traditional Chinese Medicine, Traditional Chinese Medicine

    Hospital affiliated to Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China

    2. Postdoctoral of Traditional Chinese Medicine Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830000, China;

    3. Respiratory Disease Research key Laboratory of Xinjiang, Urumqi 830000, China;Abstract:Objective Transmission electron microscope were used to observe the pathological changes of pulmonary tissue and diaphragm of abnormal savda syndrome of chronic obstructive pulmonary disease(ASSCOPD). Methods ASSCOPD model was set up by tracheal dripping PEE+ smoking+ fed with cold food diet under cold-dryness environment, stimulated with electric foot shocks. Pulmonary tissue and diaphragm were observed by Transmission electron microscope. Results pulmonary alveolar wall of normal rats was thin and intact,pulmonary alveoli was clear. Lamellar bodies in the type Ⅱpneumocytes did not show any sigh of abnormal. In abnormal savda syndrome of chronic obstructive pulmonary disease(ASSCOPD) group, There were macrophages in pulmonary alveolar,also lysosome increased, myelinfigure appearance. itochondrial swelling, Reduced density matrix of the mitochondrial, more loosely arranged. Diaphragm cell with abnormal contraction, local muscular filaments, myofibrillar dissolution, swelling of mitochondria, appear brick-like changes. Conclusion ASSCOPD belong to moderate and severe COPD, Ultrapathological structural changes not only appearance in pulmonary but also in diaphragm, It may be one of the major pathological changes of ASSCOPD.

    Keywords:Chronic Obstructive Pulmonary Disease; Abnormal Savda Syndrome; Ultrastructural Morphological; Pulmonary; Diaphragm

    流行病學(xué)調(diào)查顯示中國(guó)七省市40 歲以上群體慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease, COPD)患病率為82%[1],新疆農(nóng)村地區(qū)50歲以上人群的COPD檢出率>10%(94/743)[2],COPD 是全球范圍內(nèi)一個(gè)重要的致殘和致死原因,給人類帶來(lái)了大量且不斷增加的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)[3],對(duì)其進(jìn)行研究和防治不可忽視。隨著COPD研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)不同的COPD患者在發(fā)病危險(xiǎn)因素、機(jī)制、臨床癥狀、影像學(xué)表現(xiàn)、年均急性加重頻次等方面存在著較大的差異,對(duì)于相同治療措施的反應(yīng)區(qū)別亦大,故對(duì)COPD進(jìn)行分型研究,以利于個(gè)性化防治的開展且臨床意義較大。根據(jù)維吾爾醫(yī)(以下簡(jiǎn)稱維醫(yī))理論,COPD可分為異常黑膽質(zhì)型、異常血液質(zhì)型、異常粘液質(zhì)型和異常膽液質(zhì)型等4型,其中以異常黑膽質(zhì)型最為多見(占4064%)[4],其病情較重、預(yù)后較差、容易產(chǎn)生變證和壞證,對(duì)患者危害較大。故選擇該亞型為研究對(duì)象,電鏡觀察研究異常黑膽質(zhì)型COPD大鼠肺組織和膈肌組織的病理改變,為后續(xù)研究提供參考。

    1實(shí)驗(yàn)材料

    11動(dòng)物清潔級(jí)雄性Wistar大鼠60只,5周齡,體重(150±20)g,購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(新)2003-0001。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)3d,自由進(jìn)食飲水。

    12藥物維藥異常黑膽質(zhì)成熟散源自古代著名維吾爾醫(yī)學(xué)家穆哈穆德·艾克拜爾·艾爾扎尼編撰的經(jīng)典名著《米扎尼·提比也》(醫(yī)學(xué)之規(guī)律),由薰衣草、小茴香、破布木果、大棗、牛舌草、香青蘭、甘草、鐵線蕨、地錦草、刺糖10味維藥組成,免煎顆粒購(gòu)自江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司。

    13儀器FLI-2000H型人工氣候箱(日本EYELA公司);BUXCO MA1320呼吸功能實(shí)驗(yàn)平臺(tái)(美國(guó)Buxco公司);BS-1105型電子天平(北京賽多克斯天平有限公司);DM600B-1顯微鏡(德國(guó)Leica公司);JEM-1230型生物用透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社);亞克力染毒箱(自制)。

    14材料哈德門牌卷煙(山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司出品,焦油量11mg,煙氣煙堿量08mg,煙氣一氧化碳量13mg);彈性蛋白酶(批號(hào):H1326040,30U/mg,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

    2實(shí)驗(yàn)方法

    21分組及模型制備按照隨機(jī)數(shù)字表法分為異常黑膽質(zhì)型COPD模型組(Abnormal savda syndrome COPD,ASSCOPD),20只、異常黑膽質(zhì)型異黑成熟劑干預(yù)組(Abnormal savda munziq,ASMCOPD)20只,對(duì)照組(Control)20只。

    異常黑膽質(zhì)型COPD組:于實(shí)驗(yàn)開始后的第30天按每100g體重氣管滴注溶于08mL生理鹽水的20U彈性蛋白酶;第1至第29天,第31至第90天每天進(jìn)行熏煙,每次熏煙箱內(nèi)放置大鼠20只,燃燒卷煙 20支,持續(xù)時(shí)間1h,上下午各一次。在此基礎(chǔ)上疊加以下處理因素[5]:第1天至第97天每天晚上將大鼠置于系統(tǒng)設(shè)置為溫度(6±2)℃、相對(duì)濕度(25%~328%)的人工氣候箱,每天10h;給予自制飼料喂養(yǎng),自制飼料由普通飼料、大麥和芫荽子按照7∶15∶15的比例配制而成;同時(shí)采用間斷足底電擊作為應(yīng)激源(輸出電壓20~30V,不定時(shí)改變電壓,間隔02~05s,每天20min)產(chǎn)生慢性應(yīng)激;所有證候造模因素持續(xù)97d。對(duì)照組:置于室溫(25±3)℃,相對(duì)濕度(60%~80%)的環(huán)境中常規(guī)飼料喂養(yǎng),在第30天以與模型組相同術(shù)式在大鼠氣管滴注等體積的生理鹽水。在第90天時(shí)給予ASMCOPD組異黑成熟顆粒灌胃,ASSCOPD組,對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃,所有組均干預(yù)7d。在第97天時(shí)對(duì)各組大鼠行無(wú)創(chuàng)幼物肺功能檢測(cè)后抽血處死大鼠,取所需組織標(biāo)本保存待檢測(cè)。

    氣管內(nèi)滴注彈性蛋白酶方法:手術(shù)器械術(shù)前高壓蒸汽滅菌(121℃,120kPa, 30min),將大鼠逐一稱重,按50 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射濃度為04%戊巴比妥鈉溶液,以鉗夾爪尖無(wú)反應(yīng)為麻醉成功標(biāo)準(zhǔn),將大鼠鈍固定于鼠板上,使用16號(hào)套管針順大鼠舌頭慢慢送入氣管,拔出針,接1mL針管(內(nèi)含所需劑量的彈性蛋白酶),置頭高腳低位,呈45°,向左傾斜,緩慢推入半量溶液,向右傾斜,再緩慢推入另外半量溶液。回到中間,注入1mL空氣,使剩余的液體全部進(jìn)入肺部,再輕拍老鼠背部,使彈性蛋白酶溶液在肺內(nèi)均勻分布。注意保溫,待大鼠清醒后放回原鼠盒中飼養(yǎng)。

    22干預(yù)方法 ASMCOPD組給予維藥異常黑膽質(zhì)成熟散灌胃,給藥量根據(jù)人的內(nèi)服劑量按照“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表” [6]進(jìn)行計(jì)算,70kg者每天異常黑膽質(zhì)成熟散劑量為30g,查閱比值表可知,200g大鼠的標(biāo)準(zhǔn)用藥量是70kg者用藥劑量的0018倍,故而得出200g大鼠每天的用藥量為054g。分早晚兩次灌胃,每次5mL。ASSCOPD組、COPD組、對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃,干預(yù)7d。

    23檢測(cè)指標(biāo)及方法

    231大鼠肺組織病理觀察在第90天和第97天將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后予下腔靜脈抽血處死,迅速摘取各組大鼠肺組織,取右肺中葉,部分氣管、支氣管,10%福爾馬林固定,病理制作組織切片程序按常規(guī)脫水、浸蠟包埋、切片(2μm),每塊組織連續(xù)切片3張,行HE染色,于光學(xué)顯微鏡下攝片觀察組織形態(tài)學(xué)改變。

    232大鼠肺組織和膈肌超微結(jié)構(gòu)觀察在第90天和第97天將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉后予下腔靜脈抽血處死,迅速摘取各組大鼠肺組織和膈肌,取右肺中葉,將肺和膈肌組織切成1mm厚左右小塊,25%戊二醛固定24h,磷酸緩沖液沖洗后2%鋨酸后固定1h;梯度乙醇脫水,并同時(shí)用溶于70乙醇中醋酸鈾進(jìn)行塊染;置于苯二甲酸二丙烯脂滲透24h;以PDAP包埋后,63°聚合72h;包埋塊進(jìn)行超薄切片;枸櫞酸鉛染色后上鏡觀察并照相。超薄切片,JEOL1230透射電鏡觀察。

    3結(jié)果

    31各組大鼠肺組織病理結(jié)果比較對(duì)照組肺泡大小基本一致,肺泡壁厚度正常,外周未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn),或見極少量炎癥細(xì)胞散在分布(A);ASSCOPD組見大量炎性浸潤(rùn),肉芽腫發(fā)生,部分肺纖維化(B);ASMCOPD組見炎性浸潤(rùn)發(fā)生,較模型改善(C)。見圖1。32各組大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)比較對(duì)照組見肺泡Ⅱ型細(xì)胞,胞內(nèi)細(xì)胞器(板層結(jié)構(gòu)小體)清晰可見,肺泡腔較為干凈(A);微絨毛較為豐富,細(xì)胞核不規(guī)則,線粒體排列緊密(B);肺泡腔較為干凈(C)。ASSCOPD組肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)單核巨噬細(xì)胞,溶酶體比較多(D);出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu)(E);線粒體腫脹,基質(zhì)密度降低,排列較為松散(F)。ASMCOPD組肺泡腔有滲出,板層體擴(kuò)張明顯,有髓樣結(jié)構(gòu)(G);線粒體密度降低,輕微腫脹(H);表面絨毛減少,肺泡腔內(nèi)有滲出,板層體擴(kuò)張(I)。見圖2。33各組大鼠膈肌超微結(jié)構(gòu)比較對(duì)照組肌纖維肌節(jié)排列整齊,肌膜下有線粒體,排列相對(duì)整齊(A),出現(xiàn)成纖維細(xì)胞(B)。ASSCOPD組出現(xiàn)肌細(xì)胞異常收縮帶、局部肌絲、肌原纖維溶解,線粒體腫脹(C);肌間質(zhì)線粒體腫脹明顯,肌節(jié)排列不整齊,形成磚墻樣改變(D);肌漿網(wǎng)擴(kuò)張,肌絲溶解“Z”線消失(E)。ASMCOPD組肌原纖維發(fā)生改變,排列紊亂(F);出現(xiàn)肌衛(wèi)星細(xì)胞,少量肌間纖維,大量線粒體輕微腫脹(G);線粒體個(gè)別腫脹,肌纖維排列紊亂,收縮異常(H)。見圖3。

    4討論

    慢性阻塞性肺疾病由于受到動(dòng)態(tài)肺過(guò)度充氣和內(nèi)源性呼氣末正壓的影響,膈肌長(zhǎng)期處于不利的機(jī)械學(xué)位置,易出現(xiàn)疲勞[7]。膈肌疲勞作為COPD發(fā)展過(guò)程中的重要環(huán)節(jié),直接影響COPD的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸[8]。呼吸肌收縮功能下降是COPD呼吸困難和活動(dòng)耐力下降的主要原因[9],而膈肌是最主要的吸氣肌,平靜呼吸時(shí)膈肌收縮活動(dòng)產(chǎn)生的潮氣量占總潮氣量的80%[10]。因此研究COPD的膈肌變化有著較大的現(xiàn)實(shí)意義,本研究同時(shí)觀察了模型肺部和膈肌的超微結(jié)構(gòu)改變。

    研究發(fā)現(xiàn)ASSCOPD組肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)炎性細(xì)胞(單核巨噬細(xì)胞),與肺部HE染色病理切片觀察有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)吻合。溶酶體增多,提示模型機(jī)體可能存在自噬-溶酶體系統(tǒng)的激活;出現(xiàn)髓樣結(jié)構(gòu),提示細(xì)胞有損傷;線粒體輕微腫脹,基質(zhì)密度降低,排列較為松散,影響機(jī)體能量的提供。而維藥異黑成熟顆粒對(duì)模型大鼠肺部此類變化的治療作用不明顯。

    針對(duì)膈肌的研究發(fā)現(xiàn),ASSCOPD膈肌結(jié)構(gòu)的改變很明顯,出現(xiàn)肌細(xì)胞異常收縮帶、局部肌絲、肌原纖維溶解,線粒體腫脹;肌間質(zhì)線粒體腫脹明顯,肌節(jié)排列不整齊,形成磚墻樣改變;肌漿網(wǎng)擴(kuò)張,肌絲溶解“Z”線消失等。而研究發(fā)現(xiàn)[11]中重度COPD膈肌呈現(xiàn)肌節(jié)斷裂,Z線消失,肌絲錯(cuò)位和連接蛋白丟失等現(xiàn)象,而輕中度COPD無(wú)明顯膈肌損傷[12-13]。提示異常黑膽質(zhì)型應(yīng)該屬于中重度COPD范疇。同樣,中、重度COPD患者膈肌纖維內(nèi)出現(xiàn)巨大線粒體及大量嵴減少、絮狀、髓樣及空泡樣變的線粒體[14]也支持這個(gè)觀點(diǎn)。而維藥異黑成熟散干預(yù)后膈肌出現(xiàn)肌衛(wèi)星細(xì)胞和少量肌間纖維。一般來(lái)說(shuō),肌損傷后會(huì)出現(xiàn)炎性反應(yīng)和肌肉重建,肌肉重建的一個(gè)特點(diǎn)是肌衛(wèi)星細(xì)胞活化,它能增殖和分化成新的肌纖維細(xì)胞[15]。這是異黑成熟散治療的可能機(jī)制之一。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)[16]中藥補(bǔ)肺健脾方也可以顯著改善COPD大鼠膈肌功能,但干預(yù)時(shí)間持續(xù)11周,故考慮本研究中給藥時(shí)間過(guò)短可能是沒有起效的關(guān)鍵因素之一,還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

    從電鏡觀察結(jié)果推測(cè),維醫(yī)異常黑膽質(zhì)型COPD屬于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中重度COPD范疇,其不僅存在肺部的超微病理結(jié)構(gòu)改變,而且膈肌的形態(tài)改變也較為明顯,細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化可能是異常黑膽質(zhì)型COPD的病理變化之一。參考文獻(xiàn)

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    (收稿日期:2016-11-29編輯:陶希睿)

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