擬南芥葉色突變體F03—06的篩選及突變基因的克隆

平步云++趙軍++安麗君

摘要：植物光合作用是人類賴以生存的基礎(chǔ)，葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的重要場所，葉色可作為葉綠體發(fā)育狀態(tài)的標(biāo)記，葉色突變體是研究光合作用機(jī)制的優(yōu)良系統(tǒng)。通過EMS誘變篩選得到一個擬南芥葉色突變體F03-06，主要表型為葉片黃綠、葉脈深綠色、生長緩慢、株型矮小。遺傳分析表明，F(xiàn)03-06突變表型受隱性單核基因控制。利用圖位克隆技術(shù)，通過粗定位和精細(xì)定位發(fā)現(xiàn)該突變體表型與擬南芥At5g54810基因的突變體表型相似。對At5g54810基因的測序結(jié)果顯示，其+865堿基由鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰?，從而使編碼的丙氨酸變?yōu)樘K氨酸。At5g54810基因被報道編碼擬南芥色氨酸合成酶的β亞基，為進(jìn)一步研究擬南芥色氨酸合成途徑與葉綠體發(fā)育之間的調(diào)控機(jī)制提供了新的遺傳材料。

關(guān)鍵詞：葉色突變體；圖位克??；葉綠體發(fā)育；色氨酸生物合成

中圖分類號：Q37；Q341 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5664-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.057

Genetic Screening and Isolation of a Leaf Color Mutant F03-06 in Arabidopsis

PING Bu-yun，ZHAO Jun，AN Li-jun

（State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas/College of Life Sciences，Northwest A & F University，

Yangling 712100，Shaanxi，China）

Abstract： Photosynthesis that is proceeded in the chloroplast plays key role for human beings survival， leaf color mutants are excellent system to study the mechanisms of photosynthesis because leaf color could be used to mark the chloroplast development status. In an effort to identify genetic factors involved in plant photosynthesis，large scale genetic screening was carried out and one color mutant F03-06 was isolated from a EMS mutagenesis library in Col-0 back ground. Compared with the wild type，F(xiàn)03-06 mutant exhibited smaller pale green rosette leaves， dark veins and also retarded growing and dwarf plant size. Genetic analysis indicated that the F03-06 mutant phenotype was controlled by a single recessive nuclear locus. Based on the map-based cloning approach and DNA sequencing，there was a single nucleotide mutation at the +865th base pair within the gene At5g54810 were found which was reported to encode the β subunit of tryptophan synthetase. In addition，the loss function mutants of At5g54810 exhibit the similar phenotype to that of F03-06，At5g54810 could correspond to the mutation gene in F03-06 background. This work will provide new genetic material for studying and revealing the mutual regulation mechanisms between tryptophan synthesis and chloroplast development.

Key words：leaf color mutant；map-based cloning；chloroplast development；tryptophan biosynthesis

光合作用是地球上規(guī)模最大的能量轉(zhuǎn)換形式，是生物界幾乎所有物種賴以生存的關(guān)鍵。葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的重要細(xì)胞器，具有半自主性，具備獨立的DNA和蛋白質(zhì)合成體系[1]。葉綠素是植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的重要色素，由于其對400～700 nm波長范圍內(nèi)的綠光吸收值低，所以大多數(shù)的植物葉片都呈現(xiàn)綠色[2]，但在某些特殊情況下，直接或者間接影響葉綠素的合成或者降解過程，造成植物體內(nèi)葉綠素的變化，就會使葉色發(fā)生變異，形成葉色突變體[3]。葉色突變大致分為白化、黃葉、淺綠、深綠、黃綠、綠黃、條紋和斑點等類型，其突變的分子機(jī)制也較為復(fù)雜，植物葉綠素合成途徑、血紅素到光敏色素生色團(tuán)生物合成途徑的任何基因發(fā)生突變，都會導(dǎo)致葉色突變體的形成[4]。另外，細(xì)胞核編碼的葉綠體基因發(fā)生突變也會導(dǎo)致葉色變異[5]。目前，葉色突變體已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)理論研究和實踐生產(chǎn)，利用葉色突變體研究植物光合作用機(jī)制，以及培育觀賞植物等。因此，發(fā)掘和篩選葉色突變體，克隆和鑒定突變基因的生物學(xué)功能具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。

本研究在大規(guī)模遺傳誘變篩選中獲得了一個擬南芥葉色突變體F03-06，該突變體蓮座葉與野生型相比葉色黃綠、葉脈深綠色、葉片較小、呈圓形、葉柄短，植株整體生長緩慢，株型矮小。利用圖位克隆技術(shù)[6]，通過粗定位和精細(xì)定位以及DNA測序分析，確定該突變基因為At5g54810，它編碼擬南芥色氨酸合成酶的β亞基[7，8]，為進(jìn)一步解釋色氨酸合成途徑與植物葉綠體發(fā)育之間的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Columbia（Col-0）和Lansberg erecta（Ler）生態(tài)型野生型擬南芥種子由本實驗室保存；Col-0背景的甲基磺酸乙酯（Ethyl methylsulfonate，EMS）突變體庫由本實驗室創(chuàng)制保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物材料的種植和培養(yǎng)方法 將Col-0背景的EMS誘變庫按pool播種在進(jìn)口品氏基質(zhì)泥炭土（Pindstrup Substrate Peat Moss）上，4 ℃處理3 d保證種子發(fā)芽的一致性，隨后移入植物生長間培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24 h持續(xù)光照，溫度（20±2） ℃，相對濕度70%。培養(yǎng)2周左右待植物長出第3、第4片真葉時觀察葉片顏色，篩選葉色異常的植物作為潛在的葉色突變體。

1.2.2 突變體遺傳背景的純化和遺傳學(xué)分析 將挑選出的表型明顯的突變體與野生型Col-0連續(xù)回交3次，純化突變體的遺傳背景并獲得BC3種子。同時，在突變體與野生型Col-0回交的過程中，通過觀察雜交F1代植株表型判斷突變的顯隱性；通過統(tǒng)計F2代群體中的分離比判斷該突變體是否由單基因突變造成。另外，通過正反交試驗驗證突變位點是否為細(xì)胞核遺傳。

1.2.3 圖位克隆 首先將背景純化的突變體與Ler生態(tài)型擬南芥進(jìn)行雜交，在雜交F2代植株中挑選具有突變體表型的植株作為圖位克隆的作圖群體。通過CTAB法提取約95棵突變體植物DNA并進(jìn)行混合構(gòu)建1個DNA混合池，利用已經(jīng)公布的均勻分布擬南芥5條染色體的27對分子標(biāo)記為引物進(jìn)行初步定位。確定突變位點的染色體區(qū)間和側(cè)翼分子標(biāo)記后，繼續(xù)擴(kuò)大作圖群體，增加分子標(biāo)記密度進(jìn)行精細(xì)定位，進(jìn)一步縮小突變位點所在區(qū)間范圍。

1.2.4 候選基因的確定 根據(jù)精細(xì)定位的區(qū)間，從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（www.arabidops-is.org）上獲得區(qū)間內(nèi)所包含的基因，查看基因注釋信息及相關(guān)參考文獻(xiàn)，篩選出候選突變基因，然后對這些候選突變基因設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，最終確定出突變位點。

2 結(jié)果與分析

2.1 F03-06突變體的獲得及表型分析

在對以Col-0背景構(gòu)建的EMS誘變庫的篩選過程中，獲得一個葉色突變體，根據(jù)命名系統(tǒng)，將其定名為F03-06（代表第三個誘變pool中篩選到的第6個突變體）。通過與Col-0野生型連續(xù)回交3次，F(xiàn)03-06的突變表型穩(wěn)定。與Col-0野生型相比，F(xiàn)03-06突變體葉色黃綠、葉脈深綠色、葉形小圓、葉柄短，植株總體生長緩慢，且株型矮?。▓D1）。由于F03-06突變體表型明顯，所以決定克隆突變基因，以期發(fā)現(xiàn)調(diào)控植物葉綠體發(fā)育的新的遺傳因子。

正反交試驗結(jié)果顯示，無論是正交還是反交，所獲得的F1代植物均表現(xiàn)與野生型一致的表型，表明突變體為該基因的隱性突變體。且F1自交后代F2中野生型表型與突變體表型個體的分離比為3∶1，符合孟德爾隱性單基因遺傳規(guī)律，這說明F03-06突變表型是受隱性的單個核基因控制。

2.2 F03-06突變基因定位

2.2.1 F03-06突變位點的粗定位 將F03-06 BC3突變體植物與Ler生態(tài)型擬南芥進(jìn)行雜交，在雜交F2代植株中挑選具有突變體表型的植株作為圖位克隆的作圖群體。利用已經(jīng)公布的均勻分布擬南芥5條染色體的27個分子標(biāo)記（圖2）和突變體DNA混合池bulk進(jìn)行染色體粗定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變位點與第5條染色體[9]上的分子標(biāo)記MSG15#1（21 164 861 bp）連鎖較為緊密（圖3）。4條泳道中樣品從左到右依次為bulk、F1、Col-0和Ler，F(xiàn)1、Col-0與Ler作為對照，以bulk為模板的PCR產(chǎn)物在分子標(biāo)記MSG15#1處只擴(kuò)增出明顯的Col-0條帶，而其余分子標(biāo)記處，以bulk為模板的PCR產(chǎn)物均擴(kuò)增出Col-0與Ler 2條條帶，說明突變位點不與這些分子標(biāo)記連鎖或者不在這些分子標(biāo)記附近。

以bulk中的95個突變體DNA為模板，以MSG15#1和新設(shè)計的分子標(biāo)記MNC17#1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示突變位點位于分子標(biāo)記MSG15#1和MNC17#1之間，所以將分子標(biāo)記MSG15#1和MNC17#1作為后續(xù)定位的側(cè)翼分子標(biāo)記。

2.2.2 突變位點的精細(xì)定位 為了進(jìn)一步縮小突變位點所在的區(qū)間，通過在側(cè)翼分子標(biāo)記區(qū)間內(nèi)增加分子標(biāo)記密度和擴(kuò)大作圖群體的數(shù)量，對F03-06突變位點進(jìn)行了精細(xì)定位。利用已有的擬南芥Col-0生態(tài)型和Ler生態(tài)型基因組數(shù)據(jù)庫，在側(cè)翼分子標(biāo)記區(qū)間內(nèi)設(shè)計了5個新的插入/刪除（In/Del）分子標(biāo)記（表1）。以這些分子標(biāo)記為引物，通過對F2作圖群體中600株突變體表型植物的基因型進(jìn)行分析，最終將突變基因定位在第5條染色體上分子標(biāo)記MRB17#1（22 194 518 bp）和MCO15#1（22 401 666 bp）之間（圖4）。該區(qū)間的物理距離為207 148 bp，在分子標(biāo)記MRB17#1和MCO15#1處的交換率分別為0.08%和0.49%。

2.2.3 候選基因的篩選與初步確定 確定了F03-06突變位點所在的區(qū)間后，為了進(jìn)一步確定造成F03-06突變表型的基因，查詢了擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（www.arabidopsis.org）。分子標(biāo)記MRB17#1（22 194 518 bp）與MCO15#1（22 401 666 bp）所包含的染色體區(qū)間中共覆蓋64個基因。其中基因At5g54810被報道定位在葉綠體中，編碼擬南芥色氨酸合成酶的β亞基，并且At5g54810基因的功能缺失突變smo1/trp2-301、trp2-8和trp2-1與F03-06突變體的表型相似，與野生型相比，表現(xiàn)為葉色黃綠、葉脈深色、葉形小圓、葉柄短，整體生長緩慢，株型矮小[10]（圖5）。

根據(jù)F03-06突變體的表型及突變位點所在的區(qū)間，推測At5g54810基因突變很有可能是造成F03-06突變表型形成的原因。為了證實這個推測，設(shè)計了At5g54810基因特異性引物（表2），以F03-06BC3突變體DNA為模板對At5g54810基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，At5g54810基因的第+865處堿基由鳥嘌呤（G）突變?yōu)橄汆堰剩ˋ），從而使所編碼的丙氨酸（A）變?yōu)樘K氨酸（T）（圖4、圖6）。這說明At5g54810基因的單堿基突變有可能是造成F03-06突變表型產(chǎn)生的原因，At5g54810有可能就是F03-06突變基因。

3 小結(jié)與討論

模式植物擬南芥基因生物學(xué)功能的解析對于其他植物功能基因的研究意義重大，其研究方法和思路可以為其他植物特別是農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物中與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的基因功能研究提供參考和借鑒。本研究通過對擬南芥Col-0野生型EMS誘變庫的篩選獲得一個擬南芥葉色突變體F03-06。與野生型相比，該突變體蓮座葉色黃綠，葉形呈小圓形，植株整體生長緩慢，株型矮小。通過圖位克隆和測序，證實F03-06突變體背景中At5g54810基因發(fā)生了單堿基突變（第+865處堿基由鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰剩?，由于EMS屬于烷化誘變劑，能使DNA鏈中的鳥氨酸烷基化，烷化的鳥氨酸與胸腺嘧啶配對，代替胞嘧啶，從而在后續(xù)的DNA復(fù)制中發(fā)生堿基替換，即G∶C變?yōu)锳∶T。對F03-06突變體背景中At5g54810基因的測序結(jié)果符合EMS誘變所形成的堿基替換，所以認(rèn)為F03-06突變表型可能是由于At5g54810基因的單堿基突變所造成的。At5g54810基因也被稱為TBS1，被認(rèn)為是編碼擬南芥色氨酸合成酶的β亞基。色氨酸不僅是合成蛋白質(zhì)也是合成許多其他植物代謝產(chǎn)物如激素[11]等所必需的，色氨酸合成酶參與色氨酸合成的重要步驟[7]，色氨酸合成途徑受阻在細(xì)胞水平上影響細(xì)胞伸長、核內(nèi)復(fù)制等過程，在整體水平上也使植株表現(xiàn)出明顯的發(fā)育缺陷表型，如植株矮小、葉色黃綠、葉脈深色等。盡管研究者已經(jīng)觀察到色氨酸合成與植物葉綠體發(fā)育之間存在調(diào)控關(guān)系，但是具體的作用機(jī)制仍不明確[12]。

本試驗所獲得的F03-06突變體為進(jìn)一步研究At5g54810基因的功能提供了新的遺傳材料，為深入研究色氨酸與植物葉綠體發(fā)育的調(diào)控關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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