利用滲透壓研究豬卵母細胞發(fā)育過程中核遷移規(guī)律

肖紅衛(wèi)++華再東++張立蘋++李莉++劉西梅++任紅艷++華文君++畢延震++鄭新民

摘要：本研究采用高滲操作液（氯化鈉）處理體外成熟卵母細胞。結果表明，發(fā)現培養(yǎng)42 h的卵母細胞，中期核與第一極體剛開始分離。培養(yǎng)44 h的卵母細胞，中期核與第一極體已經分離，達到15°。培養(yǎng)46 h的卵母細胞，中期核與第一極體之間的角度達45°。培養(yǎng)48 h的卵母細胞，中期核與第一極體之間的角度達到近90°，中期核開始向卵母細胞中遷移。經過高滲處理的卵母細胞經過后續(xù)操作后可以得到克隆個體。結果表明，利用體外成熟培養(yǎng)42～44 h的卵母細胞進行去核操作，可以達到近100%的去核效率，而不會影響胚胎的正常發(fā)育。

關鍵詞：豬卵母細胞；體外成熟；核移植；克隆胚胎

中圖分類號：S828.3+5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）21-5574-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.034

Use Osmotic Pressure to Study the Metaphase Nucleus Migration

in Porcine oocyte Development

XIAO Hong-wei，HUA Zai-dong，ZHANG Li-ping，LI Li，LIU Xi-mei，REN Hong-yan，

HUA Wen-jun，BI Yan-zhen，ZHENG Xin-min

（Institute of Animal and Veterinary Science，Hubei Academy of Agricultural Science/Hubei Key Lab of Animal Embryo and Molecular Breeding，Wuhan 430064，China）

Abstract： This experiment was conducted to research the nuclear migration rules in porcine oocytes development. Hypertonic oocyte manipulation medium（NaCl） was used to deal with the IVM oocytes. The results showed that the first polar body in the 42 h cultured oocytes were isolated from metaphase nucleus. In 44 h cultured oocytes，the metaphase nucleus and the first polar body had been separated，reaching 15 degrees. In 46 h cultured oocytes，the intermediate nucleus and the first polar body between the angle of 45 degrees. In 48 h cultured oocytes，the intermediate nucleus and the angle between the first polar body reached nearly 90 degrees，metaphase nucleus began to migrate to the oocytes. After the hypertonic treatment，the oocytes were treated with nuclear transplantation，and the clones were obtained. The results suggested that in vitro maturation of oocytes，the oocytes of 42～44 h could achieve nearly 100% of the nuclear efficiency without affecting the development of embryos.

Key words： porcine oocytes；IVM；nuclear transplatation；embryo clone

在進行核移植操作時，作為核受體的卵母細胞為早期胚胎的發(fā)育提供了大量必需的營養(yǎng)物質，為了后期胚胎的發(fā)育，操作者需要迅速判斷卵母細胞質量。通常判斷卵母細胞質量的依據有對卵母細胞形態(tài)和成熟度的考察，卵母細胞所處的成熟時期與盲吸去核的質量和效率密切相關，成熟的好壞直接影響著克隆胚胎能否最終發(fā)育成正常個體。

第一極體（First polar body，Pb1）出現后，隨著培養(yǎng)時間的增加，第一極體與中期染色體的位置發(fā)生變化，中期染色體逐漸偏離Pbl向卵中央移位，有的卵Pbl退化，而失去定位標志，以第一極體為參照的盲吸去核法對卵母細胞成熟后可以進行去核操作的窗口期的把握要求嚴格，必須要在第一極體與中期染色體的位置最靠近時操作最好。

卵母細胞的膜是個半透膜，具有完整功能細胞膜的卵母細胞具有生理學意義，在人類輔助生殖上已經開始利用滲透壓篩選具有完整膜功能的精子，而在卵母細胞的篩選上還沒有利用滲透壓篩選優(yōu)質卵母細胞的研究。在研究第一極體與中期染色體位置的方法上，通常采用熒光染料后進行研究，而該種染料對重構胚的發(fā)育影響很大。本研究從滲透壓角度，研究卵母細胞的篩選以及卵母細胞體外成熟培養(yǎng)時間對第一極體與中期染色體位置變化的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

卵母細胞的培養(yǎng)器皿購自Nunc公司；FBS購自Hyclone公司；其他藥品除特殊注明外均購自Sigma公司。卵巢取自武漢某屠宰場。

1.2 主要溶液

洗卵液為改良TL-Hepes-PVA液；成熟液為改良的TCM199；操作液為添加0.017 5 g NaCl的Hepes-TCM-199；胚胎培養(yǎng)液為NCSU-23。

1.3 卵母細胞的體外成熟及核受體卵母細胞的準備

1）按孫健等[1]的方法準備真空泵及其附屬裝備，并調節(jié)負壓值為0.02個大氣壓。用16號針頭抽取卵巢上直徑在3～6 mm的卵泡。顯微鏡下挑取顆粒細胞包裹完整、胞質均勻的卵丘卵母細胞復合體（Cumulus-oocyte complexes，COCs），將挑選的COCs放入成熟液中培養(yǎng)40～48 h，培養(yǎng)條件為39 ℃，5% CO2，飽和濕度。

2）培養(yǎng)40～48 h后，將卵母細胞移入0.1%透明質酸酶中在漩渦振蕩儀上處理1 min，之后移入洗卵液中洗滌3次，換到新操作液里處理30 min后，在顯微鏡下觀察。

1.4 試驗設計

1.4.1 利用Spindle viewer觀察卵母細胞 利用“1.3”所獲得的卵母細胞，在顯微鏡下觀察核的位置。

1.4.2 利用滲透壓處理卵母細胞 利用“1.3”所獲得的卵母細胞在高滲液處理，在顯微鏡下觀察中期核突出現象。

1.5 核供體細胞準備

無菌操作取出出生后5 d的豬耳部組織，常規(guī)0.25%胰蛋白酶（GIBCO公司）消化法分離組織細胞，原代細胞采用DMEM（GIBCO公司）添加20%胎牛血清貼壁培養(yǎng)，傳代細胞采用DMEM添加10%胎牛血清貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為38.5 ℃，5%CO2、95%空氣的氣體環(huán)境，飽和濕度。用3～5代的接觸抑制成纖維細胞用于核移植試驗。

1.6 核移植及胚胎移植

1.6.1 去核/注核 將豬成熟卵和消化好的成纖維細胞放入覆蓋有石蠟油的含有7.5 mg/L細胞松弛素B（Cytochalasins B，CB）的操作液中，在顯微鏡下采用盲吸法去核，用外徑120～150 μm，內徑25～30 μm的固定吸管固定卵母細胞，用去核針撥動卵母細胞使其旋轉并使第一極體位于4～5點鐘方向，用內徑20～25 μm，尖端傾角為45°的去核針從3點鐘方向刺進透明帶并吸出第一極體（Frist polar body，Pbl）及其附近1/4～1/5胞質。

用Injection pipette從操作皿底撿拾呈單個存在的供體細胞，順著去核后留下的孔進針，釋放細胞進卵周隙中，并使之與豬卵母細胞膜緊密接觸。

1.6.2 融合/激活 采用直流電介導融合/激活，參數為DC（直流電）：1.0～1.5 kV/cm，1次脈沖，60 μs或1.3 kV/cm，2次脈沖，60 μs。

1.6.3 克隆胚的培養(yǎng)/胚胎移植 融合后的克隆胚在NCSU-23+7.5 μg/mL CB培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h后換成沒有CB的NCSU-23培養(yǎng)液，經過24～48 h培養(yǎng)后利用外科手術法對前一天有靜立反射的母豬進行胚胎移植。

1.7 仔豬出生

母豬移植胚胎后，單圈喂養(yǎng)，經過2個情期后用B超檢測母豬妊娠狀態(tài)，確認懷孕的母豬經過精心喂養(yǎng)后，待仔豬出生。

2 結果與分析

2.1 利用Spindle viewer觀察卵母細胞

由圖1可知，培養(yǎng)48 h的卵母細胞在Spindle viewer觀察下，中期核與第一極體之間的角度達90°。

自從克隆羊“多莉”問世后，體細胞核移植技術突飛猛進，并且在優(yōu)秀動物個體復制、瀕危動物保護以及細胞分化研究中取得一些舉世矚目的成就，已成為生命科學研究的熱點領域之一。由于豬在生理、形態(tài)上與人的器官非常相似，近年來應用豬的體細胞核移植技術研制人類基因疾病的動物模型，以及生產基因敲除豬、用于人異種器官移植成為豬核移植相關研究的熱點方向之一[1，2]。就體細胞核移植而言，成功克隆出小豬的概率總體只有1%，極大制約核移植克隆豬相關工作的開展[3，4]。去核胞質能否成功融合是克隆成功的關鍵步驟之一，融合率的高低也直接影響到核移植的總體效率。影響融合效率的因素包括：去核胞質與供體之間的黏合方式，融合過程施加的交流電、直流電的頻率、脈沖大小，以及融合的步驟、供體直徑的大小等。Kragh等[5]應用兩步融合參數，第一步融合后，間隔1 h，進行第二步融合，獲得了較高的融合率及囊胚發(fā)育率。Lagutin等[6]應用一步融合法進行融合，縮短了核移植操作時間，同樣得到較高的融合率并產出無透明核移植的豬。陸鳳花等[7]在水牛核移植的研究中發(fā)現，交流電對于直徑為20～30 μm的供體細胞的融合率無顯著影響；但對于直徑小于15 μm的供體細胞，能顯著提高其融合率。本試驗探討不同電融合參數對融合效率的影響，以及電融合參數對豬手工克隆重構胚胎發(fā)育潛能的影響，從而優(yōu)化豬HMC的技術體系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清（FBS）購于Gbico公司；TCM-199粉劑、DMEM粉劑購于美國Gbico公司；激素為eCG，hCG購于美國Sigma公司，其他化學試劑均購置于美國Sigma Aldrich公司。ECM2001型細胞融合儀，BTX 450型融合槽，DN-10式胚胎積聚針，卵母細胞成熟培養(yǎng)皿：35 mm及60 mm塑料平皿，去核切割刀自制，胚胎培養(yǎng)皿：四孔板。

1.2 卵母細胞的成熟

培養(yǎng)卵巢從南寧市的屠宰場獲取，裝入含有雙抗的生理鹽水中，用保溫壺在4 h內送回實驗室。先用普通生理鹽水把卵巢沖洗干凈，然后加入預熱的含雙抗的生理鹽水，送回胚胎室抽取卵母細胞。用10 mL的注射器抽取卵巢表面2～6 mm的卵泡，卵泡液放入試管中靜置，棄上清，留沉淀部分分裝。挑選含有3層及以上有顆粒/卵丘細胞包被、折光性良好的卵丘卵母細胞復合體（COCs），放入成熟液中（含10 IU/mL hCG+10 IU/mL eCG）培養(yǎng)，20～22 h后換成不含激素的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)18～20 h至細胞成熟。

1.3 胎兒成纖維細胞的培養(yǎng)（組織塊培養(yǎng)法）

胎豬從南寧市屠宰場獲取，置于雙抗生理鹽水中，4 h內送回實驗室。先用生理鹽水清洗3遍，轉移至無菌超凈臺，分離出部分大腿組織，之后用含雙抗的PBS清洗2遍，放入60 mm的平皿，將其剪碎至2～3 mm的組織塊，往培養(yǎng)皿中加入少量含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，用鑷子將其均勻鋪開，在皿蓋作好標記，將其倒扣于培養(yǎng)箱中，4 h后加入少量培養(yǎng)液，防止組織塊漂浮。24 h后在平皿底部加滿培養(yǎng)液，48 h后繼續(xù)觀察成纖維細胞的生長狀況，待成纖維細胞生長至90%左右匯合度時，進行傳代，用作豬手工克隆供體細胞。

1.4 卵母細胞的去核方法

挑選優(yōu)質的卵母細胞置于洗卵液中，吹打數次以去除顆粒細胞。然后將其移入鏈霉蛋白酶溶液中，透明帶開始變形時，立即移入含20% FBS的洗液（T20）中洗滌，然后放入T20中等其恢復成圓形，用玻璃吸管將卵母細胞轉移至切割液（含2.5 μg/mL CB）中，挑選恢復完整的卵母細胞用于去核。

極體定位法：挑取第一極體完整的細胞，將極體置于6點或12點的位置，用切割刀切去極體方向約1/3的卵胞質，去核胞質留做后續(xù)試驗。

1.5 供/受體細胞的黏合/融合/激活采用一步融合法

黏合/融合/激活分為3步，首先進行黏合，然后再進行融合/電激活，最后進行化學激活。

黏合1：先用植物凝集素（PHA）把去核半卵和供體細胞黏合，形成半卵-供體細胞配對物；然后再用另一個去核半卵與配對物黏合，形成卵-供體-卵式的黏合體（形成三角狀），移入電融合液中待融合。

黏合2：先用PHA把兩個去核半卵和供體細胞黏合，然后再把供體細胞黏合于其中一個胞質的一端，形成卵-卵-供體式的黏合體，移入電融合液中待融合。

融合/電激活：將黏合體均勻放入融合槽中，加入適量的電融合液，采用一步融合法，設置不同的電融合參數：參數1（AC：6 V/cm；DC：1.6 kV/cm， 80 μs，1次）、參數2（AC：6 V/cm；1.8 kV/cm，80 μs，1次）、參數3（AC：6 V/cm；2 kV/cm，80 μs，1次）、參數4（AC：6 V/cm；2.2 kV/cm，80 μs，1次）。電激活完成后放入培養(yǎng)箱中恢復30 min，然后檢查其融合/激活情況。

化學激活：將融合后的重構胚放入PZM-3中激活，其含5 μg/mL CB和10 μg/mL CHX，每滴激活液中放入1枚重構胚，激活4 h。

1.6 重構胚的微穴培養(yǎng)

為保證無透明帶的HMC重構胚能夠在相對獨立的環(huán)境下生長，本研究采用微穴培養(yǎng)法。將激活后的胚胎轉移到預先在CO2培養(yǎng)箱中平衡至少4 h并且有石蠟油覆蓋的PZM-3中的微穴中。微穴的制備：用胚胎聚集針在四孔板底部均勻旋轉扎微穴，微穴大小根據試驗的要求設置，每個微穴中放入1枚胚胎。48 h觀察卵裂率，160～168 h觀察囊胚率。

1.7 囊胚細胞計數收集

第6～7天的囊胚，于CCM中清洗2～3次后，置于10 μmol/mL Hoechst 33342染液，室溫中避光染色15 min，取出后再用CCM清洗2～3次，石蠟-凡士林封片，熒光顯微鏡下觀察記錄囊胚細胞總數目。

1.8 數據統(tǒng)計

試驗數據由SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同黏合方法的融合效率

去核后的半卵胞質，用兩種不同的方式進行黏合：卵-供體-卵、卵-卵-供體式黏合（圖1），采用一步融合法，施以適當的融合參數。由表1可知，以卵-供體-卵的黏合方式進行融合，其融合率高達（88.26±0.58）%，顯著高于以卵-卵-供體的黏合方式的融合率（75.38±0.82）%。

2.2 不同電融合參數對融合率的影響

卵-供體-卵式的黏合體用4組不同的參數進行融合/激活，參數1：AC：6 V/cm；DC：1.6 kV/cm，80 μs，1次脈沖；參數2：AC：6 V/cm；1.8 kV/cm，80 μs，1次脈沖；參數3：AC：6 V/cm；2 kV/cm，80 μs，1次脈沖；參數4：AC：6 V/cm；2.2 kV/cm，80 μs，1次脈沖。由表2可知，4組參數中，在條件不變的前提下（脈寬80 μs，1次脈沖），4組參數對HMC重構胚的胞質融合率差異不顯著。對供體核的融合率而言，參數3、4與參數1、2相比，HMC重構胚的供體核融合率顯著提高。

2.3 不同電融合參數對HMC重構胚發(fā)育效果的影響

由表3可知，兩個參數對HMC重構胚卵裂率的影響差異不顯著，而參數3的囊胚率以及細胞計數顯著高于參數4。

3 討論

去核半卵的黏合方式對胞質及供體核的融合起關鍵作用。卵-卵-供體式的黏合方式，比較簡便利于操作，可提高操作效率；卵-供體-卵式的黏合方法，相對比較耗時，但可以提高融合效率。兩個胞質將供體夾在中間，增加了供體細胞與胞質及胞質與胞質之間細胞膜的黏附能力，這樣使整個細胞串的結構變得更穩(wěn)定，由于它們緊密的接觸也使融合率提高達（90%～95%）[8]。本試驗采用一步融合法進行融合，比較卵-卵-供體、卵-供體-卵兩種不同黏合方式對對胞質及供體核融合效率的影響，結果表明，卵-供體-卵式的融合率顯著高于卵-卵-供體式。

目前核移植程序中，應用最廣泛的電融合方法是在直流脈沖前施加適當的交流電脈沖。施加的交流電，能使細胞產生極化，偶極的形成促使細胞膜之間緊密接觸并與細胞定位，同時膜-膜接觸面垂直于電場，從而提高融合率。Smith等[9]的研究表明，融合時直流脈沖前施加交流電脈沖，對于提高融合率有較好的效果。因此本研究施以較低的交流電壓6 V/cm，以提高胞質的融合率。就融合步驟而言，豬卵母細胞手工克隆研究中有報道使用兩步融合法[10，11]，也有報道使用一步融合法[12]，這兩種方法的融合效率相當，本研究為提高工作效率采用了一步融合法。Booth等[13]在豬卵母細胞手工克隆研究中，采用一步法進行胞質融合，其融合率達85%，本研究的融合效率達83.75%，81.78%與其保持一致。任子利等[12]研究表明直流脈沖在一定的范圍內，隨著脈沖的增大，融合效率隨之提高，本研究中的直流脈沖從1.6 kV/cm增加至2.2 kV/cm，其融合效率也從73.39%增加到81.78%，與其結論相似。本研究比較了參數3：AC：6 V/cm；2 kV/cm，80 μs，1次脈沖；參數4：AC：6 V/cm；2.2 kV/cm，80 μs，1次脈沖對HMC重構胚發(fā)育效果的影響，結果表明，兩個參數對HMC重構胚卵裂率的影響差異不顯著，而參數3的囊胚率以及細胞計數顯著高于參數4。這與李日聰等[14]的研究結果相一致。這可能是由于2.2 kV/cm的直流脈沖影響了卵母細胞膜上發(fā)生了較多的不可逆電擊穿和裂解，從而影響了HMC重構胚的后續(xù)發(fā)育能力，進而影響了囊胚率以及囊胚的細胞總數。

4 結論

卵-供體-卵的黏合方式有利于提高胞質的融合率；融合參數3（2 kV/cm，80 μs，1次）和參數4（2.2 kV/cm，80 μs，1次）有利于提高去核胞質的融合率，兩個參數對HMC重構胚的卵裂率的影響差異不顯著，但參數3的囊胚率以及囊胚細胞總數顯著高于參數4。

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2.2 利用滲透壓處理卵母細胞

由圖2至圖5可知，培養(yǎng)42 h的卵母細胞，中期核與第一極體剛開始分離；培養(yǎng)44 h的卵母細胞，中期核與第一極體已經分離，達到15°；培養(yǎng)46 h的卵母細胞，中期核與第一極體之間的角度達45°；培養(yǎng)48 h的卵母細胞，中期核與第一極體之間的角度達到近90°，中期核開始向卵母細胞中遷移。

2.3 克隆豬的出生

本研究順利得到克隆豬個體（圖6），說明本研究中通過滲透壓篩選的卵母細胞不影響克隆后代的出生。

3 討論

在核移植中，供體細胞都是經過同期化處理過的，而大多數豬卵母細胞在經過去核、融合/激活后不能發(fā)育到囊胚，除了不理想的培養(yǎng)條件外，所處不合適時期的卵母細胞重編程供體細胞的程度不夠很可能是主要的限制因素。在豬卵母細胞成熟過程中核質成熟不同步，在核成熟（以第一極體排出為標志）時胞質還沒有成熟，而繼續(xù)培養(yǎng)時中期核與第一極體之間的位置又會有變化。紡錘體成像系統(tǒng)可以對卵母細胞紡錘體進行觀測來指導去核操作，對照紡錘體成像系統(tǒng)所得照片發(fā)現，只要去掉極體以及發(fā)現為中期核所在位置的胞質，去核效率可以達到近100%。

然而由于紡錘體成像系統(tǒng)比較昂貴，本課題組從滲透壓角度來研究豬卵母細胞發(fā)育過程中核遷移的規(guī)律。Wang等人[2-4]研究發(fā)現，質量不同的卵母細胞的滲透調節(jié)機能存在差異，在核移植的去核操作中采用3SCOM處理小鼠卵母細胞，后經IVF和ET，已得到產仔。Zhou等[5]利用0.3 mol/L的蔗糖溶液處理排出第一極體的成熟卵母細胞，發(fā)現體外成熟的山羊卵母細胞在高滲液中呈現不同形態(tài)，根據這些形態(tài)選擇卵母細胞可以獲得比培養(yǎng)前按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級卵標準篩選生物卵母細胞更高的注射后存活率、受精率和桑椹/囊胚率。這從另外的角度說明體外成熟的卵母細胞的質量跟是否排出第一極體沒有關系。

本研究用氯化鈉替代蔗糖添加到操作液中對培養(yǎng)后卵母細胞進行處理，發(fā)現培養(yǎng)42 h的卵母細胞，中期核與第一極體剛開始分離。培養(yǎng)44 h的卵母細胞，中期核與第一極體已經分離，達到15°。培養(yǎng)46 h的卵母細胞，中期核與第一極體之間的角度達45°。培養(yǎng)48 h的卵母細胞，中期核與第一極體之間的角度達到近90°，中期核開始向卵母細胞中遷移。在去核操作時選擇在體外已經培養(yǎng)了42～44 h的卵母細胞，這樣的卵母細胞中的極體和中期核之間的距離很小，在去核操作時能夠達到近100%的去核效率。

由于在本研究中采用的是200枚以上的重構胚進行移植，沒有研究滲透壓處理對胚胎的囊胚發(fā)育率的影響。本研究中經過高滲處理的卵母細胞經過后續(xù)操作后可以得到克隆個體，與蘭宗寶等[6]研究發(fā)現的適當提高培養(yǎng)液的滲透壓不會損害豬胚胎結論相同。

高滲處理卵母細胞可以在去核環(huán)節(jié)提高去核效率，從而提高豬體細胞核移植技術體系的效率，為克隆豬的產業(yè)化奠定了基礎。

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