CYP2W1在胃癌中的表達及其生物學功能研究

劉東升，黃天臣

（1.河南護理職業(yè)學院，河南 安陽 455000；2.安陽市腫瘤醫(yī)院，河南 安陽 455000）

CYP2W1在胃癌中的表達及其生物學功能研究

劉東升1，黃天臣2

（1.河南護理職業(yè)學院，河南 安陽 455000；2.安陽市腫瘤醫(yī)院，河南 安陽 455000）

目的 探討CYP2W1在胃癌組織中的表達情況，研究其生物學功能。方法 采用免疫組化法檢測326例胃腺癌組織及326例正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白的表達情況；采用Western blotting實驗隨機檢測10例胃腺癌組織和10例正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白的表達情況；建立4組胃癌組織、1組正常胃黏膜組織細胞系，應用實時熒光定量PCR檢測各組細胞系中CYP2W1 mRNA的表達量；通過平板克隆、劃痕愈合實驗研究其對胃癌細胞增殖和遷徙侵襲能力的影響。結果胃癌組織中，CYP2W1蛋白表達明顯高于正常胃黏膜組織（P＜0.05）。胃癌細胞中CYP2W1 mRNA的表達量明顯高于正常胃黏膜細胞（P＜0.05）。CYP2W1陽性胃癌細胞的克隆形成數量明顯高于正常胃黏膜細胞（P＜0.05）。24 h/48 h CYP2W1陽性胃癌細胞劃痕修復速率明顯高于正常胃黏膜細胞，CYP2W1陽性胃癌細胞劃痕愈合面積明顯大于正常胃黏膜細胞，二者比較差異有顯著性（P＜0.05）。結論 CYP2W1僅在胃癌組織中表達，在正常胃黏膜組織中不表達；CYP2W1與胃癌細胞的生長增殖及遷徙侵襲能力明顯相關。

胃癌；CYP2W1；增殖；侵襲

胃癌（gastric cancer，GC）為消化道腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤。關于胃癌發(fā)生浸潤和轉移的基因及分子標記物的研究對胃癌的早期診斷、治療、預后評估具有重要的臨床意義。CYP2W1為細胞色素P450超家族的新成員之一，具有腫瘤特異性。關于胃癌中CYP2W1的表達及其與胃癌增殖及侵襲能力關系的研究，迄今尚未見國內外報道。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源

收集2010年3月至2015年3月于安陽市腫瘤醫(yī)院接受胃癌根治術治療的326例胃癌患者的手術標本，以多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，分別用于HE染色及免疫組織化學染色。新鮮標本保存于液氮中，用于Western blot實驗。正常胃黏膜組織：取自距癌組織邊緣5 cm以上的手術標本，經病理學證實為正常胃黏膜組織。人胃癌細胞系（BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MGC-803）由上海社會科學院細胞庫提供，常規(guī)傳代培養(yǎng)。正常胃黏膜上皮細胞系（GES-1）購于上海復祥生物公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 染色步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用雙評分半定量積分法，對CYP2W1的免疫組化結果進行分析。以出現棕黃色或棕色顆粒的細胞作為陽性細胞，CYP2W1的陽性部位在細胞質，高倍（400倍）鏡下，隨機選取5個視野（每個視野計數細胞數不少于200個）。陽性細胞＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；陽性強度評分：細胞無染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。將陽性細胞數得分和陽性強度得分相乘，0分為（-），1～4分為（+），5～8分為（++），≥9分為（+++），將（++）和（+++）樣本判定為陽性表達，（-）和（+）樣本判定為陰性表達。

1.2.2 Western blot實驗 使用細胞組織快速裂解液裂解組織，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白質含量，-70℃保存。制備SDS-PAGE，蛋白電泳分離蛋白后轉膜，將硝酸纖維素膜放入封閉液中，置于37℃恒溫搖床上，低速搖動封閉2 h。將一抗按1∶1 000稀釋（參考抗體說明書），4℃搖床低速搖動過夜孵育。洗脫緩沖液洗滌3次，時間分別為15 min、10 min、5 min。洗滌后進行二抗孵育，二抗為羊抗兔，按1∶4 000稀釋，置于37℃恒溫搖床上，低速搖動孵育45 min。洗脫緩沖液洗滌3次，每次5 min。ECL顯色，暗房中曝光，顯影定影后膠片保存攝片，掃描后用Bandscan 5.0軟件進行灰度分析。

1.2.3 實時熒光定量PCR 引物設計：CYP2W1上游引物AAGACGGTGGTGCTGACGG，下游引物GCTGGATGAGCTGGAAGATGG，長度106 bp；GAPDH上游引物TCAAGAAGGTGGTGAAGCA，下游引物AAAGGTGGAGGAGTGGGT，長度113 bp。引物由上海生工生物公司合成。提取胃癌細胞系（BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MGC-803）和正常胃黏膜上皮細胞（GES-1）中總RNA，紫外分光光度計測量總RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。逆轉錄合成cDNA，qPCR擴增。qPCR反應條件為：94℃、5 min（預變性）一個循環(huán)；94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、90 s，共35個循環(huán)；72℃、10 min，4℃、2 min。對擴增曲線所獲得的Ct值進行分析，利用以前報道的2-△△Ct計算方法，算出CYP2W1mRNA的相對表達量。

1.2.4 平板克隆形成實驗 選取對數生長期（BGC-823、GES-1）細胞，常規(guī)處理，重懸成單細胞懸液，調整細胞濃度至1× 103/ml，接種，連續(xù)培養(yǎng)。出現肉眼可見的克隆時終止細胞培養(yǎng)，PBS液漂洗，固定，加入姬姆薩染液，沖洗，干燥。計數肉眼可見克隆形成的數量，或在低倍鏡下計數大于50個細胞的克隆數?？寺⌒纬陕?（克隆數/200）×100%。

1.2.5 劃痕愈合實驗 24孔板背后劃線，將BGC-823、GES-1以0.25%胰酶消化，制備培養(yǎng)單層細胞。當細胞鋪滿全空時，劃痕，記錄鏡下劃痕區(qū)相對距離。繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0 h、24 h、48 h用PBS洗掉劃落的細胞，于倒置顯微鏡下拍照。倒置顯微鏡下測量細胞向致傷區(qū)遷移的相對距離，計算細胞實際遷移距離。采用Image J軟件檢測劃痕面積，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（1-各時間點劃痕面積/開始的劃痕面積）×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數據均采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。免疫組化結果相關分析采用χ2檢驗。統(tǒng)計數據用均數±標準差（±s）表示，使用獨立樣本t檢驗，多個樣本均數比較應用單因素方差分析（One-way ANOVA），以α=0.05為顯著性水準。

2 結果

2.1 CYP2W1蛋白在胃癌組織與正常胃黏膜組織中的表達

CYP2W1蛋白主要表達于癌細胞胞質，胞膜也有不同程度表達，呈淺黃至棕黃色。胃癌組織的CYP2W1陽性表達率為26.69%，顯著高于正常胃黏膜組織（0.00%）。胃癌組織與正常胃黏膜組織CYP2W1的陽性表達率有顯著性差異（χ2=100.396，P=0.000），見表1。

表1 胃癌與正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白表達比較

2.2 Western blot實驗胃癌組織及正常胃黏膜組織CYP2W1蛋白的表達

應用Western blotting實驗對隨機選取的10例胃癌組織及10例正常胃黏膜組織中的CYP2W1蛋白表達水平進行檢測。結果顯示，胃癌組織中CYP2W1蛋白表達水平顯著高于正常胃黏膜組織（見表2），差異有顯著性（P＜0.05）。

表2 胃癌與正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白表達情況

2.3 實時熒光定量PCR檢測不同胃癌細胞中CYP2W1 mRNA水平

4株胃癌（BGC-823、SGC-7901、MKN-28、MGC-803）細胞中CYP2W1 mRNA表達水平明顯升高，而正常胃黏膜細胞（GES-1）中CYP2W1 mRNA基本無表達，二者比較差異有顯著性（P＜0.05）。此外，BGC-823細胞中CYP2W1 mRNA表達水平顯著高于SGC-7901、MKN-28、MGC-803細胞（P＜0.05），而后3種細胞CYP2W1 mRNA表達水平無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4 BGC-823及GES-1細胞平板克隆形成實驗結果

正常胃黏膜細胞（GES-1）克隆形成的數量（25.18±4.36）明顯少于CYP2W1陽性胃癌細胞（BGC-823）克隆形成的數量（57.92±8.17），差異有顯著性（P＜0.05）。正常胃黏膜細胞（GES-1）克隆形成率（12.59%）明顯低于CYP2W1陽性胃癌細胞（BGC-823）克隆形成率（29.96%），差異有顯著性（P＜0.05），表明CYP2W1陽性胃癌細胞的增殖能力明顯增強。

2.5 劃痕實驗檢測胃癌細胞的遷徙侵襲能力

應用劃痕實驗檢測胃癌細胞的遷徏侵襲能力，按劃痕實驗要求逐步操作，拍照記錄0 h、24 h、48 h細胞的遷移變化，檢測劃痕面積，計算劃痕愈合率。結果顯示：24 h/48 hCYP2W1陽性胃癌細胞（BGC-823）劃痕修復率明顯高于正常胃黏膜細胞（GES-1），CYP2W1陽性胃癌細胞（BGC-823）劃痕愈合面積明顯大于正常胃黏膜細胞（GES-1），二者比較差異有顯著性（P＜0.05），表明CYP2W1陽性胃癌細胞的遷徙侵襲能力明顯增強。

3 討論

臨床研究表明，CYP2W1作為一種特異性的腫瘤因子在近30%的結腸癌中表達，而在正常健康組織中不表達或無意義[1，2]。Stenstedt K等[3]應用免疫組化法檢測CYP2W1在235例II期和III期結腸癌中的表達情況。結果顯示：CYP2W1在30%的腫瘤中高水平表達，CYP2W1陽性表達水平與腫瘤惡性程度呈正相關。有學者研究發(fā)現，CYP2W1在結直腸癌原發(fā)性腫瘤、淋巴結轉移及肝轉移進展過程中的表達呈升高趨勢，1/3的淋巴結轉移、近一半的肝轉移患者CYP2W1高表達。

本研究結果：326例胃癌組織中，87例CYP2W1表達陽性，陽性表達率為26.69%。顯著高于正常胃黏膜組織（0.00%），胃癌組織與正常胃黏膜組織CYP2W1陽性表達率有顯著性差異（χ2=100.396，P=0.000）。應用Western blotting實驗隨機檢測10例胃腺癌組織和10例正常胃黏膜組織中CYP2W1蛋白表達情況，進一步證實該結論。采用平板克隆形成實驗檢測BGC-823細胞增殖能力，結果顯示：BGC-823克隆形成數量明顯高于GES-1，差異有顯著性（P＜0.05）。劃痕愈合實驗顯示：24 h/48 hBGC-823劃痕愈合率明顯高于GES-1，BGC-823劃痕愈合面積明顯大于GES-1，差異有顯著性（P＜0.05）。

研究表明[4]，在結直腸癌細胞系實驗中，表達CYP2W1的細胞系（SW480）顯示兩種化合物：ICT2705和ICT2706，轉換后將CYP2W1共價結合到DNA，導致細胞死亡，而化合物本身對腫瘤細胞無傷害作用。異種移植研究發(fā)現，在SCID小鼠體內移植表達CYP2W1的結直腸腫瘤細胞，然后應用ICT2706治療，已顯示出完全抑制腫瘤細胞生長但對動物本身無明顯傷害的可喜結果。該研究證明，ICT2705和ICT2706這兩種混合物，能夠被CYP2W1激活而成為有效的抗腫瘤劑。CYP2W1作為腫瘤靶向治療的一種新的藥物治療靶標，可能成為腫瘤治療的又一方法。

[1]Karlgren M，Gomez A，Stark K，et al.Tumor-specific expression of the novel cytochrome P450 enzyme，CYP2W1[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，341（2）：451-458.

[2]Gomez A，Karlgren M，Edler D，et al.Expression of CYP2W1 in colon tumors：regulation bygene methylation[J].Pharmacogenomics，2007（8）：1315-1325.

[3]Stenstedt K，Hallstrom M，Johansson I，et al.The expression of CYP2W1：a prognostic marker incolon cancer[J].Anticancer Res，2012（32）：3869-3874.

[4]Travica S，Pors K，Loadman P M，et al.Colon cancer-specific cytochrome P4502W1 converts duocarmycin analogues into potent tumor cytotoxins[J]. Clin Cancer Res，2013（19）：2952-2961.

R735.2

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1671-1246（2017）03-0151-02