1例陰道定植阿薩希毛孢子菌的基因鑒定及隨機擴增多態(tài)性DNA分析

楊艷平 時曉玉 張穎 李文 王潔娣 黃文明 樊翌明

(1.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科；2.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，524001 湛江)

·病例報告·

1例陰道定植阿薩希毛孢子菌的基因鑒定及隨機擴增多態(tài)性DNA分析

楊艷平1時曉玉1張穎2李文1王潔娣1黃文明1樊翌明1

(1.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科；2.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，524001 湛江)

報道1例阿薩希毛孢子菌陰道定植病例。1例25歲健康婦女偶有陰道分泌物稍增多及輕微瘙癢。婦科檢查見少量淡黃色均質(zhì)化分泌物附著于陰道黏膜，陰道分泌物Nugent評分3分。對兩次陰道分離菌株進行形態(tài)學觀察、溫度試驗、尿素酶試驗、藥敏試驗、3個rDNA基因測序及隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD)分析。間隔3個月兩次陰道分泌物培養(yǎng)均分離出土黃色、表面皺褶的酵母樣菌落。該菌在25～37℃生長良好，最佳生長溫度為27℃。小培養(yǎng)可見分隔菌絲、假菌絲、關(guān)節(jié)菌絲、分生孢子、關(guān)節(jié)孢子和芽生孢子。尿素酶試驗陽性。3個rDNA基因測序和RAPD分析顯示兩次分離菌株為同一種阿薩希毛孢子菌。E-test和Neo-Sensitabs藥敏試驗發(fā)現(xiàn)本菌株對伏立康唑敏感。隨訪3個月患者仍無明顯癥狀。

阿薩希毛孢子菌；陰道；定植；藥敏試驗

目前已知毛孢子菌屬共有51個種，其中16個種可引起人類疾病[1]。毛孢子菌可定植于人類皮膚、呼吸道、胃腸道和陰道，引起表淺和深部毛孢子菌病、過敏性肺炎[2]。雖然陰道標本中偶可分離出毛孢子菌，但其致病性尚未明確。1985年以來，陰道標本中分離的毛孢子菌共有28株[3-11]，其中僅有皮瘤毛孢子菌 (Trichosporoninkin)可能引起外陰陰道毛孢子菌病[3]。2012年8月～2013年3月，我們共收集了301例可疑的外陰陰道念珠菌病患者陰道分泌物，其中1例無明顯癥狀婦女兩次分離到阿薩希毛孢子菌 (T.asahii)。本研究觀察了該菌株的形態(tài)學特征，并進行溫度試驗、尿素酶試驗、基因鑒定及隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD)分析。

1 臨床資料

患者女，25歲，因婚前體檢于2012年11月到我院婦產(chǎn)科門診就診。平素身體健康，偶有陰道分泌物稍增多及輕微瘙癢，無長期服用抗生素、激素或免疫抑制劑病史。月經(jīng)規(guī)律，否認陰道沖洗、經(jīng)期性交、盆浴，但長期穿化纖緊身內(nèi)褲。該患者及性伴無性病史，采用避孕套避孕7 a。婦科檢查見外陰皮膚正常，陰道無明顯充血，可見少量淡黃色均質(zhì)化分泌物附著于陰道黏膜，伴有輕度宮頸肥大和糜爛，子宮及附件未見異常。陰道分泌物檢查鱗狀上皮細胞 (+)，Nugent評分3分，pH 3.8，氨味試驗陰性，未見芽生孢子及假菌絲。陰道分泌物接種在2支含有氯霉素沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (SDA)上27℃培養(yǎng)14 d，可見土黃色、表面皺褶的酵母樣菌落生長。血常規(guī)、肝腎功能檢查無異常。

由于臨床癥狀不明顯，患者未予治療。3個月后隨訪，患者仍無明顯癥狀。復查陰道分泌物鏡檢結(jié)果Nugent評分3分，pH 4.4，氨味試驗陰性。革蘭染色鏡檢發(fā)現(xiàn)2個革蘭陽性長柱形關(guān)節(jié)孢子黏附于鱗狀上皮細胞上，細胞外少量革蘭陰性短桿菌 (見圖1)。真菌培養(yǎng)結(jié)果與前次相同。此后患者失訪。

2 真菌學研究

2.1 菌落形態(tài)學觀察

由于首次分離菌株 (ZJ199)和第2次分離菌株 (ZJ199-2)相同，故真菌學研究僅用ZJ199菌株，阿薩希毛孢子菌 (CBS2479)作為對照菌株。菌株分別接種于大平皿SDA、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基 (CMA)、酵母菌形態(tài)瓊脂培養(yǎng)基 (YMA)27℃培養(yǎng)14 d。本菌株在SDA上3 d即有淡黃色菌落生長，直徑6 mm，表面不光滑；7 d菌落直徑11 mm，奶黃色，表面粗糙，中央隆起、皺褶，周邊呈粉末狀 (見圖2a)；9 d菌落直徑15 mm，菌落形態(tài)與7 d時相似，背面平坦呈淡黃色。CMA和YMA上菌落形態(tài)大致相同，但菌落生長較慢。

2.2 微量培養(yǎng)

本菌株接種于小鋼圈SDA、CMA 27℃和37℃培養(yǎng)，顯示不同培養(yǎng)基上生長差異較大。CMA 27℃培養(yǎng)5 d，可見真菌絲與假菌絲形成混合菌絲 (見圖2b)；37℃培養(yǎng)6 d，可見關(guān)節(jié)菌絲由長方形、矩形關(guān)節(jié)孢子連接而成，其上著生側(cè)生孢子 (見圖2c)。SDA 37℃培養(yǎng)6 d，可見卵圓形或橢圓形孢子形成假菌絲，偶見假頭狀分生孢子著生于孢梗上 (見圖2d)。

2.3 溫度試驗

本菌株接種于試管SDA上，分別置于4℃、8℃、25℃、27℃、37℃、42℃、44℃培養(yǎng)2周。結(jié)果顯示，27℃生長最佳，菌落直徑14 mm；25℃、37℃生長良好，菌落直徑11 mm；42℃生長一般，菌落直徑7 mm；4℃、8℃、44℃均無菌落生長，但將其轉(zhuǎn)至27℃培養(yǎng)1周后仍有菌落生長。

2.4 尿素酶實驗

本菌株和對照菌株分別接種于尿素培養(yǎng)基試管中，27℃培養(yǎng)2周。結(jié)果顯示2個菌株均能使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，呈陽性反應。

2.5 0.1%放線菌酮和20%NaCl耐受試驗

本菌株和對照菌株分別接種于含0.1%放線菌酮SDA培養(yǎng)基試管、含20%NaCl MEA培養(yǎng)基試管上，27℃培養(yǎng)2周。結(jié)果顯示2個菌株均有菌落生長，說明二者均可耐受0.1%放線菌酮、20%NaCl。

2.6 藥敏試驗

采用NeoSensitabs紙片 (丹麥Rosco公司)和E-test藥敏條 (瑞典AB Biomerieux公司)進行體外藥敏試驗，按說明書進行操作。NeoSensitabs紙片法提示本菌株對伏立康唑敏感，兩性霉素B和咪康唑中度敏感，伊曲康唑、氟康唑、卡泊芬凈和特比萘芬耐藥。E-test藥敏結(jié)果顯示本菌株對伏立康唑、氟康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈的最低抑菌濃度 (MIC)分別為0.25 mg/L、64 mg/L、>32 mg/L、>32 mg/L、>32 mg/L，提示其僅對伏立康唑敏感。

2.7 基因鑒定

用真菌DNA提取試劑盒 (美國Omega公司)提取ZJ199、ZJ199-2、ZJ3063、CBS2479菌株DNA，其中ZJ3063菌株是從1例疑為股癬患者皮損中分離的阿薩希毛孢子菌。真菌引物ITS1/ITS4、NL1/NL4、26SF/5SR分別用于擴增rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ITS)、D1/D2區(qū)、基因間隔區(qū)1 (IGS1)[12-13]。擴增產(chǎn)物送廣州華大基因科技有限公司測序，測序結(jié)果與GenBank上有關(guān)序列進行BLAST分析。本實驗所測的CBS2479 ITS、IGS1、D1/D2區(qū)序列，與GenBank上該菌株相應序列 (登錄號分別為FJ943429、FJ754250、EU559350)完全一致。由于ZJ199、ZJ199-2菌株具有相同序列，故僅將ZJ199菌株ITS (485 bp)、IGS1 (582 bp)、D1/D2區(qū) (571 bp)序列提交至GenBank，登錄號分別為KF501144、KF501145、KF501146。序列比對結(jié)果：本菌株ITS、IGS1、D1/D2區(qū)序列與GenBank中部分阿薩希毛孢子菌同源性達100% (ITS：FJ943429、KC127676；IGS1：JX111988、EU934811；D1/D2區(qū)：FJ463632、EU559350)。然而，本菌株與CBS2479 IGS1序列覆蓋率和同源性分別為100%、97%，存在17個堿基差異。

2.8 RAPD分析

25個隨機引物 (OPF-01～OPF-20、ATGS、OPAO-15、OPI-03、OPI-14、OPK-20)由上海生工生物工程股份有限公司合成，預實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)OPAO-15 (5’-GAA GGC TCC C-3’)和OPI-14 (5’-TGA CGG CGG T-3’)可獲得清晰、穩(wěn)定、重復性好的特異性條帶。RAPD反應體積15 μL，其中模板DNA 2 μL，5 pmol/L引物1 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，25 mmol/L MgCl21 μL，5 U/μL Taq聚合酶 (Takara公司)0.2 μL，10×緩沖液1.5 μL，雙蒸水8.3 μL。反應條件：預變性94℃ 2 min；變性94℃ 1 min，退火38℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，共循環(huán)36次；最后延伸72℃ 10 min。上述反應產(chǎn)物中加入6×加樣緩沖液1 μL，取混合液8 μL于1.2%瓊脂糖凝膠上電泳100 min，4S Green核酸染料 (上海生工生物工程股份有限公司)染色，紫外線凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

OPAO-15和OPI-14引物的RAPD結(jié)果顯示菌株ZJ199與ZJ199-2的電泳條帶一致，但其與對照菌株 (CBS2479、ZJ3063)電泳條帶有明顯不同 (見圖3)，提示兩次分離的阿薩希毛孢子菌可能為同一菌株。

圖1 陰道分泌物革蘭染色鏡檢顯示2個革蘭陽性長柱形關(guān)節(jié)孢子黏附于鱗狀上皮細胞，細胞外少量革蘭陰性短桿菌 (×1 000) 圖2 阿薩希毛孢子菌培養(yǎng)：a.27℃ SDA培養(yǎng)7 d，奶黃色菌落直徑11 mm，表面粗糙，中央隆起、皺褶，周邊呈粉末狀；b.混合菌絲 (CMA，27℃，5 d，×400)；c.關(guān)節(jié)菌絲及其側(cè)生孢子 (CMA，37℃，6 d，×400)；d.假菌絲及孢梗上著生假頭狀分生孢子 (SDA，37℃，6 d，×1 000) 圖3 阿薩希毛孢子菌RAPD分析 (1.Marker；2.CBS 2479；3.ZJ3063；4.ZJ199；5.ZJ199-2)：OPAO-15、OPI-14顯示2個陰道分離菌株 (ZJ199、ZJ199-2)電泳條帶一致，但與對照菌株 (CBS2479、ZJ3063)電泳條帶有明顯不同

Fig.1 Gram-stained smear showed two Gram-positive cylindrical arthroconidia on a squamous cell and some small gram-negative rods (Gram-stain,×1 000) Fig.2 Culture results ofTrichosporonasahii:a.A creamy,11 mm in diameter,heaped-up and wrinkled colony with a furrowed farinose margin on SDA at 27℃ for 7 days;b.Mixed hyphae on CMA at 27℃ for 5 days (×400);c.Arthrofilaments and lateral conidia on CMA at 37℃ for 6 days (×400);d.A pseudohypha and conidiophore bearing false-headed conidia on SDA at 37℃ for 6 days (×1 000) Fig.3 RAPD analysis ofTrichosporonasahii(1.Marker;2.CBS 2479;3.ZJ3063;4.ZJ199;5.ZJ199-2):The electrophoretic bands of two vaginal siolates (ZJ199 and ZJ199-2) for OPAO-15 and OPI-14 were identical,but different from the control strains (CBS 2479 and ZJ3063)

3 討 論

由于白吉利毛孢子菌 (T.beigelii)名稱已在1990年代廢除，故在1980年代報道的6株陰道毛孢子菌難以確定種類[4-5]。2003年以來，陰道分泌物中共分離出毛孢子菌22株，包括皮瘤毛孢子菌14株、阿薩希毛孢子菌1株、星形毛孢子菌 (T.asteroides)1株、日本毛孢子菌 (T.japonicum)1株及未定種5株[3,6-11]。Makela等[3]在13例患者陰道分泌物中分離到皮瘤毛孢子菌，其中9例合并其他感染、3例無癥狀，僅1例有復發(fā)性外陰陰道炎癥狀并排除其他感染。呂雪蓮等[6]報道了國內(nèi)首例皮瘤毛孢子菌陰道定植病例。

阿薩希毛孢子菌是深部毛孢子菌病的最常見病原菌[2]，但其是否引起陰道炎尚不清楚。Abliz等[12]在我國1例阿薩希毛孢子菌引起的系統(tǒng)性感染患者陰道內(nèi)分離出該菌，這是血源性播散的結(jié)果。Arechavala等[7]在94例阿根廷急性外陰陰道念珠菌病患者中，分離出1株阿薩希毛孢子菌[7]，但其可能是定植而非感染。根據(jù)異常陰道菌群分級[13]，本例患者具有正常陰道pH (3.8～4.4)和菌群 (Nugent評分3分)，未見白細胞；雖然間隔3個月陰道分泌物中兩次分離出阿薩希毛孢子菌，但僅在第2次涂片發(fā)現(xiàn)少量關(guān)節(jié)孢子附著于鱗狀上皮細胞，也無菌絲出現(xiàn)；在未予治療的情況下，隨訪3個月仍然缺乏陰道炎癥狀。這些結(jié)果表明本例患者陰道內(nèi)阿薩希毛孢子菌處于定植狀態(tài)。

傳統(tǒng)真菌鑒定方法不能有效區(qū)別毛孢子菌種，至少需要同時應用2個rDNA基因才能準確鑒定至種的水平[2]。本菌株的ITS和D1/D2區(qū)序列與CBS2479完全一致，但兩者的IGS1序列有17個堿基差異，說明IGS1適用于鑒別毛孢子菌[14]。隨機引物OPAO-15已用于確定阿薩希毛孢子菌種內(nèi)差異[12,15]。本研究篩選了25個隨機引物，發(fā)現(xiàn)OPAO-15和OPI-14可有效鑒別阿薩希毛孢子菌。OPAO-15和OPI-14的RAPD結(jié)果顯示菌株ZJ199與ZJ199-2的電泳條帶一致，但與對照菌株有明顯差異。根據(jù)3個rDNA基因測序和RAPD分析，提示患者的兩次分離菌株為同一菌株。

藥敏試驗顯示毛孢子菌對三唑類抗真菌藥物的敏感性高于兩性霉素B和棘白菌素類，其中伏立康唑最敏感[2]。阿薩希毛孢子菌對唑類抗真菌藥物的敏感性優(yōu)于非阿薩希毛孢子菌，特別是伏立康唑和泊沙康唑[8]。本文的E-test和Neo-Sensitabs紙片法發(fā)現(xiàn)本菌株對伏立康唑敏感，提示伏立康唑可能是外陰陰道毛孢子菌病最有效藥物。此外，與M27-A2微量肉湯稀釋法相比，NeoSensitabs紙片法不能區(qū)別兩性霉素B耐藥酵母菌[16]。本菌株用E-test顯示對兩性霉素B耐藥，而NeoSensitabs紙片法為中度敏感，提示紙片法可能不適用于判斷阿薩希毛孢子菌對兩性霉素B敏感性。

綜上所述，本文首次報道無癥狀婦女陰道中存在阿薩希毛孢子菌持久性定植，但其臨床意義有待進一步證實。

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Vaginal colonization ofTrichosporonasahiiin an asymptomatic woman using gene identification and random amplified polymorphic DNA

YANG Yan-ping1,SHI Xiao-yu1,ZHANG Ying2,LI Wen1,WANG Jie-di1,HUANG Wen-ming1,FAN Yi-ming1

(1.DepartmentofDermatology;2.DepartmentofGynecologyandObstetrics;AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China)

To report a case of vaginal colonization ofTrichosporonasahii.A 25-year-old healthy woman occasionally developed mild itching and vaginal discharge.Gynecological examination showed a small amount of yellowish homogenous vaginal discharge.Nugent score of vaginal discharge was 3.Two strains isolated from vaginal discharge were analyzed by phenotypic observation,temperature test,urea enzyme test,antifungal susceptibility test,3 rDNA gene sequencing and random amplified polymorphic DNA (RAPD).The earthy yellow and wrinkled yeast-like colonies were twice isolated from the vaginal discharge at 3-month intervals.The isolate grew well at 25-37℃,with the optimal growth temperature of 27℃.Slide culture revealed septate hyphae,pseudohyphae,arthrofilaments,conidia,arthroconidia,and blastospores.The strain was urease positive.Both isolates belonged to the same strain ofT.asahiiusing 3 rDNA gene sequencing and RAPD analysis.E-test and Neo-Sensitabs results revealed that the isolate was sensitive to voriconazole.The woman remained asymptomatic during 3-month follow-up.

Trichosporonasahii;vagina;colonization;antifungal susceptibility

34-37]

國家自然科學基金 (81171512)

楊艷平，女 (漢族)，碩士，主治醫(yī)師.E-mail:41505019@qq.com

樊翌明,E-mail:ymfan1963@163.com

R 379.9

A

1673-3827(2017)12-0034-04

2016-01-15 [本文編輯] 王 飛