前列腺素受體亞型FP—V2與早孕藥物流產(chǎn)結(jié)局的分析

馬超　馮文華　韓維田

[摘要]目的 比較FP、FP-V1和FP-V2在完全流產(chǎn)患者與不完全流產(chǎn)患者早孕蛻膜中mRNA的表達(dá)差異。方法 選取2013年6月～2015年3月遼寧省計(jì)劃生育科研院門(mén)診主動(dòng)要求藥物流產(chǎn)終止正常妊娠的50例患者作為研究對(duì)象，根據(jù)流產(chǎn)是否完全分為完全組（30例）和不完全組（20例）。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)兩組早孕蛻膜中FP、FP-V1和FP-V2的表達(dá)差異。結(jié)果 不完全組早孕蛻膜中的FP和FP-V2的mRNA表達(dá)顯著高于完全組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組的FP-V1表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 人早孕蛻膜FP-V2 mRNA高表達(dá)可能與不完全流產(chǎn)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]FP-V2亞型；藥物流產(chǎn)；蛻膜；不完全流產(chǎn)；早孕

[中圖分類號(hào)] R719.3+1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）01（a）-0009-04

米非司酮配伍米索前列醇終止早孕最早應(yīng)用于1988年并且已經(jīng)在31個(gè)國(guó)家廣泛開(kāi)展[1]。在中國(guó)，米非司酮配伍米索前列醇的完全流產(chǎn)率可以達(dá)到93%左右[2]，但是仍有部分婦女遭受流產(chǎn)不全帶來(lái)的困擾，存在著流血時(shí)間長(zhǎng)、生殖系統(tǒng)感染和貧血等一系列問(wèn)題[3]。米非司酮是一種合成類醇，具有抗孕酮、糖皮質(zhì)激素和輕度抗雄激素特性，其靶結(jié)合位點(diǎn)是孕激素受體PR[4]。較早的研究認(rèn)為，米非司酮抗早孕的機(jī)制是絨毛膜和蛻膜組織細(xì)胞失去孕激素的支持，使得蛻膜組織和絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生變性、壞死，最終導(dǎo)致胚胎死亡而終止妊娠[5]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，米非司酮可以使蛻膜組織中孕激素受體（PR）表達(dá)下降[6]，人絨毛促性腺激素（β-HCG）[7]、雌二醇（E2）和睪酮（T）均持續(xù)增加；同時(shí)米非司酮還可以下調(diào)蛻膜中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）與其受體的轉(zhuǎn)錄，提高血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平[8]。盧士燕等[9]報(bào)道，應(yīng)用米非司酮后，CD56+特別是CD16+表達(dá)明顯增高，提示NK細(xì)胞表達(dá)增高，殺傷活性增強(qiáng)，在藥物流產(chǎn)中發(fā)揮一定作用。

總結(jié)以上的研究來(lái)看，藥物流產(chǎn)是一個(gè)多方面、多因素參與的過(guò)程。藥物流產(chǎn)雖然已經(jīng)在臨床開(kāi)展了三十余年，但其終止早孕的機(jī)制仍不清楚。前列腺素受體在哺乳動(dòng)物生殖過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵而復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。前列腺素參與卵泡排出的過(guò)程[10]，在胚胎植入過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]，在生產(chǎn)過(guò)程中多種前列腺素受體分別表達(dá)于子宮和子宮肌層來(lái)發(fā)揮各自不同的生物學(xué)作用[12]。雖然前列腺素受體在生殖領(lǐng)域發(fā)揮復(fù)雜的作用，但是前列素受體在藥物流產(chǎn)過(guò)程中的作用未見(jiàn)有報(bào)道。本研究選取我院的正常早孕、且主動(dòng)要求選擇藥物流產(chǎn)終止妊娠的健康婦女作為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)早孕蛻膜中FP、FP-V1和FP-V2表達(dá)的差異，探討其與藥物流產(chǎn)結(jié)局的關(guān)系，以便進(jìn)一步為研究藥物流產(chǎn)的機(jī)制提供思路，為流產(chǎn)不全患者減少痛苦和困擾。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2013年6月～2015年3月遼寧省計(jì)劃生育科學(xué)研究院門(mén)診主動(dòng)要求藥物流產(chǎn)終止正常妊娠的50例患者作為研究對(duì)象，所有患者在組織收集前均簽署知情同意書(shū)。蛻膜取自正常妊娠<49 d、經(jīng)B超診斷為宮內(nèi)妊娠、尿液妊娠試驗(yàn)確診為陽(yáng)性的健康藥物流產(chǎn)患者。根據(jù)流產(chǎn)是否完全分為完全組（30例）和不完全組（20例），兩組的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2分組

1.2.1完全組 在米非司酮和米索前列醇用藥6 h內(nèi)，孕囊能夠完全排出。

1.2.2不完全組 在6 h內(nèi)不能排出孕囊或孕囊排出不完整。

1.3儀器及試劑

PCR儀（美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)生物公司，Veriti 9902）；實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用系統(tǒng)生物公司，ABI7000）；組織RNA提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司，RN05）；逆轉(zhuǎn)錄酶（TAKARA公司，DRR047S）；SYBR Premix Ex TagTMⅡ（TAKARA公司，DRR037A）。

1.4組織RNA提取

按照艾德萊組織RNA試劑盒的操作流程進(jìn)行提取，提取的RNA置于-80℃冰箱備用。

1.5反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量

反轉(zhuǎn)錄以組織RNA為模板，反應(yīng)體系為：5×Buffer 2 μl，Oligo dT Primer 0.5 μl，Random 6 mers 0.5 μl，RT Enzyme 0.5 μl，RNA 500 ng，RNase Free dH2O補(bǔ)足至10 μl。37℃ 30 min，85℃ 15 s。

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)體系為：SYBR Prime Ex TaqTM 10 μl，PCR正反向引物各0.8 μl，ROXⅡ 0.4 μl，ddH2O 7 μl。反應(yīng)參數(shù)為95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 31 s，共40個(gè)循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△CT相對(duì)定量的方法進(jìn)行計(jì)算。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對(duì)定量PCR結(jié)果采用單因素ANOVA分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 FP-V2在人早孕蛻膜中的表達(dá)

隨機(jī)選取4例患者蛻膜組織，采用RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)到FP-V2在人早孕蛻膜組織均有表達(dá)（圖1）。

2.2 FP、FP-V1和FP-V2在完全組和不完全組藥物流產(chǎn)蛻膜組織中的表達(dá)

不完全流產(chǎn)組蛻膜中FPmRNA（8.35±0.28）的表達(dá)明顯升高，是完全組（3.17±0.22）的2.63倍（P<0.05）（圖2A）。FP-V1 mRNA在完全組和不完全組蛻膜中的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖2B）。不完全流產(chǎn)組蛻膜中FP-V2 mRNA（11.32±0.88）的表達(dá)明顯升高，是完全組（4.51±0.46）的2.51倍（P<0.05）（圖2C）。

3討論

米非司酮配伍米索前列醇是一個(gè)成熟、有效的終止早孕的方法，但是仍有部分婦女承受藥物流產(chǎn)不完全（5%）、流血過(guò)多（3%）和繼續(xù)妊娠（1%）的困擾[13]。在米非司酮配伍米索前列醇流產(chǎn)過(guò)程中，陰道出血的風(fēng)險(xiǎn)也在升高[14]。雖然藥物流產(chǎn)在臨床中被廣泛應(yīng)用，但是其是一個(gè)多因素參與的過(guò)程，主要機(jī)制仍不明確。此外，也有多種臨床標(biāo)準(zhǔn)如子宮內(nèi)膜厚度、藥物流產(chǎn)次數(shù)和β-hCG[15]等來(lái)判斷和預(yù)測(cè)流產(chǎn)的結(jié)局，但是，仍未找到一個(gè)準(zhǔn)確、可靠的指標(biāo)來(lái)指導(dǎo)臨床，因此，尋找一個(gè)明確的因素來(lái)預(yù)測(cè)藥物流產(chǎn)的結(jié)局至關(guān)重要。本研究擬從藥物流產(chǎn)的敏感性出發(fā)，來(lái)研究與藥物流產(chǎn)敏感性相關(guān)的因子，探索藥物流產(chǎn)的機(jī)制，更好地為臨床解決實(shí)際問(wèn)題。

蛻膜是母-胎界面來(lái)自母體的重要組成部分，具有廣泛的生物學(xué)功能，除了具有營(yíng)養(yǎng)支持作用外，還具有合成分泌、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能，在妊娠過(guò)程中具有重要意義。同時(shí)蛻膜是PGF2α合成和代謝的主要場(chǎng)所，并且蛻膜也是其發(fā)揮作用的場(chǎng)所[16]。在早期妊娠過(guò)程中，米非司酮可以使PGF2α的合成增多，代謝減少。前列腺素FP受體子宮內(nèi)膜異位癥的血管生成增加[17]，生產(chǎn)過(guò)程中的子宮肌層增加[18]，前列腺素PGF2α在生產(chǎn)過(guò)程中是一個(gè)重要的生產(chǎn)啟動(dòng)因素，但是在藥物流產(chǎn)方面未見(jiàn)報(bào)道。妊娠生產(chǎn)過(guò)程和藥物流產(chǎn)都是妊娠終止過(guò)程，前列腺素FP受體在生產(chǎn)過(guò)程有重要作用，那么從前列腺素FP受體入手，找到一個(gè)可以預(yù)知藥物流產(chǎn)結(jié)局的因素，可以為更好地研究和理解藥物流產(chǎn)機(jī)制提供思路。

前列腺素受體FP包含F(xiàn)P-V1和FP-V2兩個(gè)亞型，F(xiàn)P-V1亞型是傳統(tǒng)亞型，目前對(duì)其研究比較透徹；但是FP-V2亞型是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)亞型，其功能幾乎未見(jiàn)報(bào)道。本研究選取4例早孕蛻膜，采用RT-PCR方法檢測(cè)到早孕蛻膜中均有FP-V2的表達(dá)，這與Hay等[19]的研究結(jié)果一致，提示FP-V2在人早孕蛻膜組織中有表達(dá)。其在蛻膜中大量特異性表達(dá)提示FP-V2可能參與妊娠的一些生理過(guò)程。此外，本研究還檢測(cè)到FP和FP-V2在不完全流產(chǎn)組蛻膜中的表達(dá)要明顯高于完全流產(chǎn)組，而FP-V1在兩組中無(wú)明顯差別，提示FP-V2在蛻膜中表達(dá)的升高與藥物流產(chǎn)的不完全有一定關(guān)聯(lián)性，這可能是影響藥物流產(chǎn)結(jié)局的一個(gè)因素。同時(shí)，總體的前列腺素FP受體在不完全組中的表達(dá)也升高，而FP-V1亞型的表達(dá)則無(wú)明顯變化，提示FP受體在不完全流產(chǎn)蛻膜中的這個(gè)升高可能也是由FP-V2的升高引起。

綜上所述，米非司酮配伍米索前列醇終止早孕是一個(gè)多因素參與的過(guò)程，在藥物流產(chǎn)的不完全組蛻膜中FP-V2表達(dá)升高，在完全組蛻膜中表達(dá)下降，提示FP-V2對(duì)于藥物流產(chǎn)過(guò)程是一個(gè)負(fù)向調(diào)節(jié)因素，其升高不利于藥物流產(chǎn)的完全性。關(guān)于FP-V2與藥物流產(chǎn)結(jié)局的關(guān)聯(lián)可以為更好地研究藥物流產(chǎn)機(jī)制提供思路和方向，同時(shí)對(duì)于FP-V2功能的進(jìn)一步探究可能會(huì)藥物流產(chǎn)不完全提供一個(gè)潛在的分子靶點(diǎn)和診療依據(jù)。

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（收稿日期：2016-10-15 本文編輯：祁海文）