口服納米銀對大鼠的生物有效性及其體內(nèi)分布的研究

江媛媛，黨菲，李敏，周東美，吳笛，施維林，朱雪峰

1. 蘇州科技大學環(huán)境科學與工程學院，蘇州 215009 2. 中國科學院南京土壤研究所土壤環(huán)境與污染修復重點實驗室，南京 210008 3. 南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院毒理系，南京 210029 4. 南京醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院江蘇省醫(yī)藥獸藥安全性評價與研究中心，南京 210029

納米銀(AgNP)由于其獨特的抗菌性能，被廣泛應用于各類商業(yè)產(chǎn)品[1]，尤其是抗菌商品，如床上用品、洗衣機、水凈化器、牙膏、洗發(fā)水、紡織物、醫(yī)藥噴霧、醫(yī)療設備、過濾器、加濕器、廚房用具和玩具等[2]。AgNP的大量使用將不可避免地造成AgNP或其他形態(tài)銀在環(huán)境中的釋放、累積，對各類生物(如雙殼貝類、魚類、真菌和其他物種)產(chǎn)生潛在風險[3-6]。此外，AgNP可用于口服產(chǎn)品，如膳食補充劑，說明AgNP同樣對人體健康造成潛在風險[7-8]。相關(guān)研究表明，含AgNP涂層的醫(yī)療設備釋放出的AgNP或銀離子會通過呼吸、皮膚接觸以及口部無意攝入等途徑進入人體，在組織中富集并且致毒[9-13]。

AgNP的人體/動物毒性研究主要包括皮膚、粘膜細胞的體外毒性和肝、肺、生殖系統(tǒng)細胞、血管系統(tǒng)細胞及神經(jīng)細胞的體內(nèi)毒性[14]。Kulthong等[15]通過將含AgNP的抗菌敷料染毒于人造皮膚的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌敷料中的銀可以釋放到汗液中，并且敷料中銀的含量、汗液的組成成分以及pH影響了敷料中銀的釋放。Park等[16]發(fā)現(xiàn)含AgNP抗菌敷料對體外培養(yǎng)的小鼠纖維細胞能產(chǎn)生毒性，并引起炎癥反應、遺傳和發(fā)育毒性等。Ahamed等[17]研究了AgNP對人工模擬大鼠肝細胞的影響，發(fā)現(xiàn)AgNP會導致肝細胞谷胱甘肽衰竭，線粒體膜電位下降，活性氧升高，證實AgNP可通過氧化應激效應誘導肝細胞中毒。Jun等[18]研究發(fā)現(xiàn)AgNP會引起人體血小板聚集，磷脂酰絲氨酸外翻，促凝血活化，最終導致血栓。對于體內(nèi)研究，主要將AgNP通過呼吸、皮膚接觸和攝入等途徑染毒于大鼠，研究大鼠相關(guān)組織中銀的富集以及對組織的損傷程度。Hyun等[19]采用呼吸途徑將AgNP染毒于大鼠28 d后，發(fā)現(xiàn)大鼠的臟器系數(shù)與對照組并無顯著性差異。Sung等[20]同樣采用呼吸途徑將AgNP染毒于大鼠，發(fā)現(xiàn)肝和肺是AgNP富集的主要靶器官。Tiwari等[21]通過皮下注射高劑量的AgNP給大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠的血漿生化指標出現(xiàn)異常，血漿活性氧含量上升。Kim等[11]通過灌胃途徑將AgNP染毒于大鼠，發(fā)現(xiàn)灌胃28 d后，大鼠血液中的堿性磷酸酶和膽固醇明顯增加，說明大鼠的肝功能或脂質(zhì)代謝出現(xiàn)了異常。Cha等[22]采用同樣途徑將AgNP染毒于大鼠，3 d后發(fā)現(xiàn)AgNP對肝產(chǎn)生毒性，肝組織淋巴細胞浸潤，并出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，此外與炎癥相關(guān)基因的表達也發(fā)生了改變。在哺乳動物體內(nèi)，AgNP還會通過氧化應激效應導致細胞中DNA受損，改變基因表達，甚至引起細胞的凋亡[23-31]。這些研究都說明AgNP具有毒性效應，且毒性效應受染毒劑量、AgNP的染毒途徑、AgNP基本性質(zhì)的影響。

盡管上述研究促進了人們對AgNP毒性效應及健康危害的理解，然而大多數(shù)研究并未考慮AgNP的生物有效性，主要停留在AgNP在大鼠體內(nèi)的分布以及毒性方面的研究[19-22, 32-35]。相關(guān)信息的缺失會導致我們無法全面認識AgNP毒性作用機理，尤其是不同劑量條件下生物反映出的不同的毒性效應。因此，了解AgNP對動物的生物有效性和生物累積過程，可能為AgNP的毒性研究提供有用的信息，以更準確評估AgNP的生態(tài)風險及人體健康風險。本文以SD大鼠為研究對象，采用灌胃途徑將大鼠進行AgNP染毒，研究AgNP對大鼠的生物有效性、體內(nèi)分布及累積動力學。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

本研究所用的聚乙烯吡咯烷酮包被的AgNP粉末購自Sigma公司，產(chǎn)品號為576832，廠家標注的納米顆粒粒徑< 100 nm，Ag的純度> 99.5%。該產(chǎn)品在25 ℃厭氧下避光保存，以防止AgNP被氧化。銀離子標準溶液(Sigma，1 000 mg·L-1)用于制備標準曲線以測定銀濃度；實驗用水為超純水(18.2 MΩ，Millipore，美國)；67%～69%的濃硝酸(優(yōu)級純)用于消解待測樣品。實驗所用玻璃容器均經(jīng)10%(V/V)硝酸浸泡24 h后，用超純水清洗干凈。

1.2 實驗動物

雌性Sprague - Dawley(SD)大鼠36只，體重160～180 g，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供。由于雌性大鼠腎組織器官中銀的累積是雄性大鼠的2倍[11]，因此，本文以雌性大鼠為研究對象。

實驗中，動物生存的環(huán)境為清潔級，人工光照時間為12 h:12 h(晝：夜)，溫度為(23 ± 1) ℃，相對濕度為55% ± 5%[36]。代謝籠為無毒鋼絲籠(ZH-B6，中國)，容積為250 mm×200 mm×200 mm，每籠3只大鼠，大鼠飲用水為凈化水，食物為無菌塊飼料。

1.3 AgNP的表征

采用超聲破碎儀(X0-650D，南京先歐儀器制造有限公司)將AgNP分散在超純水中，且超聲破碎功率為390 w，時間間隙3.0 s，以此獲得均勻懸浮液，用滴管吸少量均勻懸浮液至碳網(wǎng)包被的銅網(wǎng)上，用JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM)檢測AgNP顆粒尺寸及形狀，同時采用BI-200SM光散射儀(DLS，Brookhaven Instruments, 美國)測定AgNP懸浮液中AgNP顆粒尺寸。采用火焰原子吸收光譜法(AAS)測得AgNP懸浮液中銀濃度為(3 132.6 ± 2.6) mg·L-1。

1.4 AgNP生物有效性實驗

將36只SD大鼠隨機分為對照組和灌胃組，每組各18只。實驗前12 h禁食(不禁水)，第2日對2組大鼠給予單次灌胃。灌胃組每只大鼠灌胃0.6 mL AgNP懸浮液，對照組每只大鼠灌胃0.6 mL超純水。灌胃結(jié)束時的時間點記為0 h，分別在1 h、8 h、24 h、96 h、168 h時，每組隨機選3只大鼠麻醉，立即從心臟取血，置于涂有肝素的Corning管中；采集肝、腎、肺、小腸、脾和腦，用超純水清洗表面殘留的血液后，用濾紙吸干，記錄組織鮮重，并于-80 ℃保存。檢測結(jié)果顯示，大鼠食物中銀的濃度低于儀器檢測濃度(0.003 mg·kg-1)，小腸內(nèi)容物并不影響實驗結(jié)果。因此，采集小腸時并未將小腸內(nèi)容物清洗掉。在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h和168 h收集大鼠的尿液和糞便，尿液加濃硝酸保存(1:1，V/V)，糞便在-80 ℃冰箱中保存。實驗期間，大鼠自由飲水并飼喂無菌塊飼料，且大鼠活動正常，未觀察到不良反應。

1.5 總銀含量分析

大鼠血液和尿液用7 mL濃硝酸和3 mL 30%的過氧化氫在25 ℃下溫和消解3～4 h后進行350 ℃消解[36-37]，直至溶液澄清，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS，Thermo-iCAP Q，美國)分析其中總銀含量。

大鼠組織和糞便首先進行冷凍干燥(ALPHA 1-2LD PLUS，德國)，并記錄組織和糞便干重。采用上述方法用濃硝酸和過氧化氫進行消解。消解完全后，以超純水定容，ICP-MS測定總銀含量。本研究采用非脫脂龍蝦肝胰腺中微量元素和甲基汞標準物質(zhì)(LUTS-1)進行實驗質(zhì)量控制，總銀的回收率為92%～105%。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0軟件的Tukey法檢驗對照組和灌胃組大鼠組織、尿液和糞便中銀濃度的顯著性差異，以及灌胃組不同時間點之間的顯著性差異。顯著性標準為P < 0.05，當P > 0.05時表明數(shù)據(jù)間不存在顯著性差異。

人的全面發(fā)展離不開人的個性的發(fā)展。人的個性發(fā)展是人的全面發(fā)展的重要組成部分。兩者的關(guān)系是辯證統(tǒng)一的。首先，人的全面發(fā)展是個性發(fā)展的基礎(chǔ)，沒有在一定限度內(nèi)的人的全面發(fā)展，個性發(fā)展就像無源之水、無本之木，它的發(fā)展是片面的，是畸形的。其次，人的個性發(fā)展是人的全面發(fā)展的前提，人要實現(xiàn)自身的全面發(fā)展必將受到個性發(fā)展的制約，只有具備個性的個體，才有全面的整體，只有尊重個體的發(fā)展，才能發(fā)揮個性，并利用個性的獨特性，使人走向全面的發(fā)展。所以說，工程師的個性具有全面性，他們的個性主要表現(xiàn)為行為特點、愛好、興趣、心理、氣質(zhì)等特點。

圖1 AgNP懸浮液的TEM圖及粒徑分布圖Fig. 1 TEM image and size distribution of AgNP in suspension

2 結(jié)果與討論 (Results and discussion)

2.1 AgNP的粒徑分布

圖1所示為AgNP的TEM圖片。由圖可見，AgNP大部分為球形顆粒，顆粒粒徑均勻分布在10～30 nm范圍內(nèi)。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，AgNP的平均粒徑為(18.5 ± 5.1) nm。DLS分析得到AgNP的水合粒徑為(35.1 ± 3.5) nm。

2.2 AgNP在大鼠體內(nèi)的分布

對照組大鼠各器官、組織中的銀濃度分別為：小腸(0.06 ± 0.02) mg·kg-1、血液(0.01 ± 0.01) mg·L-1、肝(0.01 ± 0.01) mg·kg-1、腎(0.04 ± 0.02) mg·kg-1、肺(0.02 ± 0.01) mg·kg-1、脾(0.05 ± 0.02) mg·kg-1、腦(0.02 ± 0.01) mg·kg-1，并且在整個實驗過程中銀濃度保持相對穩(wěn)定。AgNP單次染毒于大鼠后，在大鼠的血液及主要組織(小腸、肝、腎、肺、脾和腦)中均能檢測到銀(圖2)。其中，小腸中銀的濃度最高(最高為132.80 ± 50.55 mg·kg-1)，其次是肝(最高為0.29 ± 0.13 mg·kg-1)、腎(最高為0.23 ± 0.04 mg·kg-1)、脾(最高為0.17 ± 0.05 mg·kg-1)、肺(最高為0.11 ± 0.01 mg·kg-1)、腦(最高為0.06 ± 0.02 mg·kg-1)。

圖2 大鼠組織中銀濃度(A:小腸, B:血液, C:肝, D:腎, E:肺, F:脾, G:腦, n=3)注：*表示對照組與灌胃組之間存在顯著性差異；不同字母表示灌胃組不同時間點之間顯著性差異(P < 0.05)。Fig. 2 Ag concentrations in tissues of rats (A: intestine, B: blood, C: liver, D: kidney, E: lung, F: spleen, G: brain, n=3)Note: *indicated the significant difference between the control group and the gavage group, and the different letter indicated the significant difference of the gavage group in different time points (P < 0.05).

小腸中銀濃度在灌胃后1 h時達到最高值(132.80 ± 50.55 mg·kg-1，圖2A)，之后下降，然而8 h、24 h和96 h暴露后的銀濃度仍然是對照組濃度的3～707倍；168 h后小腸銀濃度和對照組沒有顯著性差異。小腸中銀累積呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，可能與小腸的生理功能相關(guān)。小腸是大鼠消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，通過消化管上皮細胞吸收的銀通過血液循環(huán)(圖2B)進入大鼠其他組織[36]；同時，由于腸液pH一般呈堿性，部分AgNP可能發(fā)生團聚，形成微米級的聚合物[35]，因此不易被吸收，將會以糞便的形式排出體外(圖3B)。上述因素均導致了小腸中銀濃度的降低。值得注意的是，除團聚外，AgNP在小腸中可能發(fā)生其他化學轉(zhuǎn)化，例如：胃液中高濃度電解質(zhì)以及低pH條件下，AgNP可能釋放銀離子，進入pH較高的腸液后，離子態(tài)的銀可能生成AgCl或Ag2S，這值得進一步研究[38-39]。此外，采用口服途徑將AgNP染毒大鼠，已報道的文獻中表明，AgNP經(jīng)胃腸消化后，大鼠血液中的銀濃度都比較低[36]。而對于小腸消化上皮細胞吸收的銀離子還是銀顆粒，目前并無相關(guān)類似報道，這也是今后值得進一步研究的內(nèi)容。

對于血液而言，染毒1 h后銀濃度最高(0.03 ± 0.01 mg·L-1，圖2B)，在8 h和24 h時銀濃度仍然是對照組濃度的11～12倍；96 h后銀濃度下降至正常水平。本研究中血液最高濃度為(0.03 ± 0.01) mg·L-1，遠低于Park報道的值(0.60 mg·L-1)[36]。后者采用了檸檬酸包被的平均粒徑為7.9 nm的AgNP溶液進行染毒，與本研究采用的AgNP的表面特性、粒徑大小均不同。

大鼠的肝、腎、肺、腦和脾中均能檢測到銀，說明銀可以通過血液循環(huán)系統(tǒng)遷移并在體內(nèi)累積，其中肝、腎、肺、脾和腦是AgNP作用的靶器官。肝、腎、肺和腦的銀濃度呈現(xiàn)相似的規(guī)律，即染毒1 h和8 h后組織銀濃度最高，之后恢復到對照組水平。這可能是這些組織重新釋放銀到了血液。在1 h時灌胃大鼠脾中銀濃度與對照組有顯著性差異，其他采樣點并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。值得注意的是，盡管是灌胃的途徑，但是在肺和腦中依然檢測到了銀。肺中檢測到銀可能是肺泡巨噬細胞能夠吞噬銀，腦中檢測到銀可能是銀穿透血腦屏障通過靜脈系統(tǒng)進入大腦導致，這與前人報道一致[34]。但是目前尚不清楚銀是以何種形式(納米顆?；蛘咩y離子)進行體內(nèi)運輸并且分布于這些組織，這值得進一步研究。

2.3 AgNP對大鼠的有效性

如圖2B所示，灌胃后1 h血液和其他組織中銀濃度達到最高值，且與對照組存在顯著性差異(P < 0.05)，說明AgNP已快速地被生物體吸收。因此，本研究通過大鼠體內(nèi)銀含量和染毒劑量的比值計算AgNP對大鼠的有效性。將灌胃后1 h時各組織中銀的含量來計算AgNP的生物有效性。每只大鼠攝入總銀量為1 879.56 μg，如表1所示，器官、組織中銀總量為159.22 μg。器官、組織中銀總量與攝入總量的比值為8.5%，說明本研究中AgNP對SD大鼠的有效性為8.5%。本研究計算出的生物有效性略高于文獻報道值(4.2%)[36]，除了采用的AgNP溶液的表面載體、粒徑大小及分布等方面的差異外，還可能與計算方法有關(guān)。文獻中采用口部攝入和尾靜脈注射2種途徑將AgNP染毒大鼠，并通過藥物動力學軟件計算大鼠血液的動力學參數(shù)(AUC)，2種途徑下AUC的比值為AgNP對大鼠的有效性。

表1 大鼠體內(nèi)AgNP生物有效性Table 1 The bioavailability of AgNP in rats

注：a表示平均值±標準偏差，b依據(jù)文獻的估算值。

Note:ashowed average value ± standard deviation, andbshowed the estimated value of the literature.

2.4 AgNP的排出

AgNP可以通過糞便或者尿液排出體外(圖3)。灌胃24 h后，尿液和糞便中銀濃度最高，分別為(0.12 ± 0.08) mg·L-1和(419.21 ± 102.03) mg·kg-1。本研究中大鼠糞便中銀濃度與已有報道相近，而尿液結(jié)果則高于已有報道[36]。168 h內(nèi)大鼠排泄物中銀總量為1 378.20 μg(其中，尿液和糞便中銀含量分別為0.25 μg和1 377.95 μg)，占染毒劑量的73%，說明了采用灌胃途徑，絕大部分AgNP將排出體外，且糞便是最主要的排出途徑。

本研究結(jié)果表明，通過灌胃途徑染毒的AgNP中約8.5%可以被SD大鼠吸收，并且通過血液循環(huán)迅速分配到各個組織；1 h時各組織的銀濃度達到最高值，之后會隨時間下降，其中，肝、腎、肺、脾和腦是AgNP的靶器官，其銀濃度的高低順序依次為肝 > 腎 > 脾 > 肺 > 腦。相對而言，大部分灌胃的AgNP并未被吸收，是通過尿液或者糞便排出體外，其中糞便可排出約73%的銀。因此，我們認為，當以灌胃的途徑單次給藥時，聚乙烯吡咯烷酮包被的AgNP經(jīng)SD大鼠的腸胃吸收后，一小部分進入血液并分配到各個組織，而大部分銀則通過糞便排出體外。由此可推測，該染毒劑量下AgNP的毒性可能不高，這將需要進一步的研究。

圖3 大鼠排泄物中銀濃度(A:尿液, B: 糞便, n=2～3, 48 h的尿液只采集到1個樣品)注：*表示對照組與灌胃組之間存在顯著性差異；不同字母表示灌胃組不同時間點之間顯著性差異(P < 0.05)。Fig. 3 Ag concentrations in excretion of rats (A: urine, B: feces, n=2-3, only one sample of urine at 48 h)Note: *indicated the significant difference between the control group and the gavage group, and the different letter indicated the significant difference of the gavage group in different time points (P < 0.05).

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