ZnO NPs對水培小麥(Triticum aestivum L)種子不同發(fā)育階段的影響

陳澤林，徐長山，張?zhí)m蘭，喬金，張海嬌，邵海玲

東北師范大學紫外光發(fā)射材料與技術(shù)教育部重點實驗室，長春130024

納米材料已被廣泛地應(yīng)用在化工、涂料、紡織、化妝品、醫(yī)藥制劑等多個領(lǐng)域[1-4]。由于其具有與體材料(粒徑在微米量級以上)不同的物理化學性質(zhì)，因此在一定條件下可能對生物體具有潛在的毒性效應(yīng)[5-8]，這方面的研究引起了人們的廣泛關(guān)注。相關(guān)的研究論文也在包括《Science》和《Nature》等在內(nèi)的期刊上相繼發(fā)表[9-11]。

氧化鋅納米顆粒(ZnO NPs)是目前應(yīng)用最廣泛的納米材料之一，大量應(yīng)用于化工、微電子、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域[12-14]。但是，已有研究表明，ZnO NPs對細菌、植物和動物等都具有非常明顯的毒性[15-19]。

近年來，關(guān)于ZnO NPs對植物毒性的報道越來越多。如Shaymurat等[20]研究了ZnO NPs對大蒜根長的影響，發(fā)現(xiàn)ZnO NPs對大蒜根的生長以及分生區(qū)的有絲分裂有明顯的抑制作用，且濃度越高毒性越大，具有顯著的濃度效應(yīng)。Watson等[21]研究了ZnO NPs對小麥的影響，發(fā)現(xiàn)在500 mg·L-1暴露濃度下，小麥根的生長會受到明顯的抑制作用。Pokhrel等[22]研究了銀納米顆粒(Ag NPs)和ZnO NPs對玉米和卷心菜的根長、發(fā)芽率、水分含量和根部形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)ZnO NPs和Ag NPs會對卷心菜的根產(chǎn)生抑制作用。Lee等[23]研究了ZnO NPs和二氧化鈦納米顆粒(TiO2NPs)對綠藻的毒性，發(fā)現(xiàn)藻類的生長與ZnO NPs和TiO2NPs的濃度有關(guān)。Xiang等[24]研究了不同粒徑大小和不同形貌的ZnO NPs對白菜種子的發(fā)芽率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度為80 mg·L-1的ZnO NPs對卷心菜的發(fā)芽率沒有影響，但是會對卷心菜的根和芽的生長有顯著的抑制，且其毒性與其尺寸和形貌有關(guān)。Chen等[25]研究了ZnO NPs對浮萍的影響，發(fā)現(xiàn)ZnO NPs對浮萍具有顯著的毒性。這些研究結(jié)果都表明，ZnO NPs對植物體具有毒性效應(yīng)，但是，有關(guān)ZnO NPs的毒性與植物種子發(fā)育階段的關(guān)系的研究尚未見報道。

本文選擇小麥(Triticum aestivum L)作為受試植物，開展了ZnO NPs對水培小麥種子不同發(fā)育階段的影響，以期能更全面準確地評價ZnO NPs對植物的毒性。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 氧化鋅納米顆粒(ZnO NPs)的制備[26]

本實驗所用的ZnO NPs是通過溶膠-凝膠法制備得到。具體過程如下：取適量鎂條(Mg，北京化工廠)、碘(I，北京化工廠)和97%的乙醇(CH3CH2OH，北京化工廠)置于蒸餾瓶中進行蒸餾，獲得400 mL的絕對乙醇。將適量醋酸鋅(Zn(CH3COO)2·2H2O，北京化工廠)和絕對乙醇加入三頸瓶中進行攪拌加熱，當溫度升至80 ℃時開始回流，回流2 h后得到透明的醋酸鋅溶液。同時，取適量氫氧化鋰(LiOH·H2O，北京化工廠)加入到絕對乙醇中并在冰水浴中超聲(KQ-250DB，350 W，昆山市超聲儀器有限公司)溶解。將溶解的氫氧化鋰按一定比例加入到透明的醋酸鋅溶液中，并用絕對乙醇稀釋。稀釋后的溶液經(jīng)冰水浴超聲30 min后放于冰箱中靜置2 d。再按一定比例加入正己烷(C6H14，北京化工廠)，經(jīng)離心、清洗、干燥后獲得白色的氧化鋅粉末。用X射線衍射儀(XRD，D/MAX-2500，Rigaku，日本)和透射電子顯微鏡(TEM，JEOL-2100F，日本電子株式會社)對制備得到的ZnO NPs進行表征。

1.2 ZnO NPs懸浮液配制

用分析天平(XS205DU，Switzertand，瑞士)稱取12 mg的ZnO NPs加入200 mL的去離子水中，水浴超聲5 min，得到200 mL濃度為60 mg·L-1的氧化鋅納米顆粒懸浮液。將200 mL的懸浮液均勻分成5份，并將其中4份的濃度分別稀釋至20、30、40和50 mg·L-1備用。

1.3 小麥的培養(yǎng)

選取200粒大小相同、籽粒飽滿、健康無病害的小麥種子，用去離子水沖洗3遍后，放入去離子水中浸泡2 h左右，再用去離子水沖洗數(shù)遍并進行消毒處理。取適量消毒后的小麥種子放于1 000 mL的燒杯中，加入20 mL的去離子水，并用封口膜封住燒杯口，在室溫下置于暗處培養(yǎng)。

1.4 用ZnO NPs處理不同發(fā)育階段的小麥種子

取出處于吸脹階段的小麥種子30粒，隨機分成6份，每份5粒，取其中5份分別置入20 mL的濃度為20、30、40、50和60 mg·L-1的ZnO NPs懸浮液中，在暗處培養(yǎng)3 d，作為實驗組。剩下的一組放入去離子水中，在同樣的條件下培養(yǎng)3 d作為對照組。取出處于萌動階段的小麥種子30粒，作上述同樣的處理。取出處于發(fā)芽階段的小麥種子30粒，隨機分成6份，每份5粒，統(tǒng)計每一份中的小麥根長后作上述同樣的處理。

1.5 用ZnO NPs和ZnSO4·7H2O水溶液處理小麥種子

取6個消毒后的1 000 mL燒杯，分成2組，每組3個。在其中一組燒杯中分別倒入20 mL的去離子水、濃度為176.66 mg·L-1的ZnSO4·7H2O溶液和濃度為50 mg·L-1的ZnO NPs懸浮液，再往每個燒杯中放入5粒處于萌動階段的小麥，置于暗處培養(yǎng)3 d。在另一組燒杯底部先各放入1張與燒杯底部同樣大小的定性濾紙，再作上述同樣處理。

1.6 統(tǒng)計學方法

在本研究中，每組實驗都重復進行了3次以上，采用SSPS 22.0軟件(SPSS Inc.)對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析。采用ANOVA方法對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析(檢驗標準為P < 0.05)。*表示P < 0.05，**表示P < 0.01。限于篇幅，種子發(fā)育的實物照片只給出了最為典型的結(jié)果。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 氧化鋅納米顆粒(ZnO NPs)結(jié)構(gòu)與形貌

圖1為溶膠-凝膠法制備得到的ZnO NPs的XRD譜和TEM圖。圖1中的A圖為ZnO NPs的XRD譜。從XRD譜可以看到其衍射峰與PDF#36-1451卡片完全一致，表明通過溶膠-凝膠法制備得到的物質(zhì)為六角纖鋅礦型氧化鋅。圖1中的B圖是ZnO NPs的TEM圖，從中可以看出制備的ZnO NPs為球形顆粒且形貌均勻，平均直徑為5 nm左右。

圖1 ZnO NPs的XRD譜(A)和TEM圖(B)Fig. 1 XRD (A) spectrum and TEM (B) images of ZnO NPs

圖2 小麥種子處于3個階段的形貌圖注：A，吸脹階段；B，萌動階段；C，發(fā)芽階段。Fig. 2 Morphology of wheat seeds at three phasesNote: A, Imbibition stage; B, Protrusion stage; C, Germination stage.

圖3 經(jīng)40 mg·L-1 ZnO 納米粒子處理后小麥的根長Fig. 3 Root lengths of wheat treated by 40 mg·L-1 ZnO NPs

2.2 3個不同發(fā)育階段的小麥種子形貌

圖2中的(A)、(B)、(C)分別是處于吸脹階段、萌動階段和發(fā)芽階段小麥種子的形貌圖。從圖中可以看出，處于吸脹階段的小麥種皮完整，顏色較深。處于萌動階段的小麥種皮變軟，顏色變淺，胚根和胚芽頂破種皮外露(俗稱露白)。處于發(fā)芽階段的小麥具有一定長度的胚根和胚芽。

2.3 ZnO NPs對小麥的毒性

圖3為處于吸脹階段、萌動階段和發(fā)芽階段的小麥種子分別用去離子水和濃度為40 mg·L-1的ZnO NPs懸浮液處理后的根長情況。從中可以看到，實驗組的小麥根長都明顯小于對照組(P<0.01)。這說明40 mg·L-1暴露濃度下，ZnO NPs對處于3個發(fā)育階段的小麥種子都具有明顯的毒性。

就萌動階段和發(fā)芽階段而言，ZnO NPs對小麥的毒性表現(xiàn)出明顯的濃度效應(yīng)。圖4為處于萌動階段的小麥經(jīng)不同濃度的ZnO NPs處理后的根長情況，圖中的插圖為小麥的實物圖。從中可以看出，ZnO NPs的濃度越高，小麥的根長越短，即具有顯著的濃度效應(yīng)，這一結(jié)果與Lin和Xing[27]的研究結(jié)果一致。而從小麥實物圖也可以看到，小麥根長隨ZnO NPs的濃度增加而明顯變短。

圖5是處于發(fā)芽階段的小麥種子在不同濃度的ZnO NPs作用下根的生長速率。從中可以看到，在ZnO NPs的作用下，小麥根的生長速率明顯低于對照組(P<0.01)。經(jīng)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)小麥根的生長速率與ZnO NPs濃度具有相關(guān)性(P<0.01)。這表明ZnO NPs對小麥根的生長速率也具有明顯抑制作用，且濃度越高抑制效果越明顯。

2.4 ZnO NPs的毒性與小麥種子發(fā)育階段的關(guān)系

圖6為處于不同發(fā)育階段的小麥種子經(jīng)不同濃度的ZnO NPs處理后的根長情況。其中(A)、(B)、(C)分別是對處于吸脹階段、萌動階段和發(fā)芽階段的小麥種子進行處理后，小麥根長與ZnO NPs濃度的關(guān)系。從中可以看出，ZnO NPs對處于不同發(fā)育階段的小麥種子都可以產(chǎn)生毒性，但是處于不同發(fā)育階段的小麥種子對ZnO NPs的耐受性不同。因此，在不同發(fā)育階段用ZnO NPs處理，對小麥根長的抑制效應(yīng)有很大區(qū)別。在吸脹階段，對小麥根長的抑制作用較小，而在萌動階段和發(fā)芽階段，對小麥根的抑制作用則非常大。

為了能更準確地比較ZnO NPs對處于不同發(fā)育階段的小麥種子的毒性大小，我們計算了3種情況下ZnO NPs對根長的抑制率，其計算公式如下：

式中的S表示實驗組小麥的平均根長，D表示對照

組小麥根的平均根長，ρ為抑制率。計算結(jié)果如圖6(D)所示，其中分別給出了在吸脹階段、萌動階段和發(fā)芽階段用ZnO NPs處理后小麥根長的抑制率。從中可以看到，在發(fā)芽階段加入ZnO NPs，其對根長的抑制效果最為明顯。當ZnO NPs濃度為30 mg·L-1時，對小麥根長的抑制率就已經(jīng)達到了63.5%，當濃度為60 mg·L-1時，對小麥根長的抑制率達到95.7%，小麥根的生長幾乎停止。而在吸脹階段加入ZnO NPs，其對小麥根長的抑制率則比較低。當ZnO NPs濃度為30 mg·L-1時，其對小麥的根長幾乎沒有抑制，即使ZnO NPs濃度達到60 mg·L-1，對小麥根長的抑制率也只有37.8%，遠遠小于同濃度下在萌發(fā)階段和發(fā)芽階段用ZnO NPs處理后的抑制率。對吸脹階段、萌動階段和發(fā)芽階段的抑制率分別進行差異性T檢驗，發(fā)現(xiàn)3組之間具有顯著性差異，其P值都小于0.05。這說明ZnO NPs對小麥的毒性確實與小麥種子的不同發(fā)育階段有關(guān)，在吸脹階段毒性最小，在發(fā)芽階段毒性最大，在萌動階段的毒性介于二者之間。

圖4 處于萌動階段的小麥種子經(jīng)ZnO 納米粒子處理后根長與ZnO 納米粒子濃度的關(guān)系注：插圖是小麥的實物圖。Fig. 4 Root lengths of wheat treated under different ZnO NPs concentrations at the protrusion stageNote: The insert is the picture of wheat.

圖5 對發(fā)芽階段的小麥種子用不同濃度的ZnO NPs處理后小麥根的生長速率Fig. 5 Root growth rates of wheat seeds treated under different ZnO NPs concentrations at the budding stage

種子萌動階段，對外界環(huán)境條件特別敏感[28]，是植物一生中對不良環(huán)境條件抵抗力最弱的時期。但是，從上述結(jié)果可以看到，ZnO NPs對處于萌動階段的小麥的毒性明顯小于發(fā)芽階段。一個容易想到的原因可能是ZnO NPs被小麥種皮吸附，有效濃度降低。為了檢驗這一想法，取30粒處于萌動階段的小麥隨機分作6等份，分別放于濃度為0、20、30、40、50、60 mg·L-1的ZnO NPs懸浮液中培養(yǎng)2 h，使小麥種皮對ZnO NPs的吸附達到飽和，取出后放入新配制的濃度同樣為0、20、30、40、50、60 mg·L-1的ZnO NPs溶液中繼續(xù)培養(yǎng)，其根長抑制率如圖7中的b組所示。圖7中的a組和c組是未經(jīng)飽和處理的萌動階段和發(fā)芽階段的抑制率。從圖7中可以看到，在20、40、50和60 mg·L-1的暴露濃度下，經(jīng)過飽和處理后的b組的抑制率變得明顯高于未經(jīng)飽和吸附處理的a組的抑制率，具有顯著性差異(P<0.05)。這說明小麥種皮對ZnO NPs的吸附確實能夠影響其毒性。

然而，從圖7中也可以看到，盡管飽和吸附處理降低了其后小麥種皮對ZnO NPs的吸附，但萌動階段的抑制率仍然小于發(fā)芽階段的抑制率(P<0.05)。這說明，還有其他的因素導致萌動階段的小麥種子對ZnO NPs的耐受性更強。我們認為，這很有可能與小麥種子發(fā)育階段獲取所需營養(yǎng)的方式有關(guān)。在萌動階段，小麥種子中胚乳所含的營養(yǎng)物質(zhì)尚可以滿足其生長需要，但進入發(fā)芽階段后，小麥種子中胚乳的養(yǎng)分幾乎耗盡，需要借助根從外界吸收養(yǎng)分[28]。因此，ZnO NPs對小麥根生長的抑制對處于萌動階段的小麥影響比較小，而對處在發(fā)芽階段的小麥影響則比較大。這也是導致了萌動階段的抑制率小于發(fā)芽階段的抑制率的一個重要因素。

圖6 ZnO 納米粒子對處于吸脹階段(A)、萌動階段(B)和發(fā)芽階段(C)的小麥根長的影響；(D)為ZnO 納米粒子對處于3個階段的小麥根長的抑制率Fig. 6 Root lengths of wheat treated under different ZnO NPs concentrations at the imbibition phase (A), the sprout phase (B) and the budding phase (C), (D) Inhibition rates of ZnO NPs on wheat roots length at three phases

圖7 處于萌動階段和發(fā)芽階段的小麥經(jīng)不同方式處理后根長的抑制率注：a, 萌動階段未經(jīng)ZnO NPs懸液飽和處理；b, 萌動階段經(jīng)過飽和處理；c, 發(fā)芽階段未經(jīng)飽和處理。Fig. 7 Inhibition rates of wheat after different treatments at the sprout phase and the budding phaseNote: a, seeds not saturated with ZnO NPs suspension in the protrusion stage; b, seeds saturated with ZnO NPs suspension in the protrusion stage; c, seeds not saturated with ZnO NPs suspension in the budding phase.

圖8 有無濾紙情況下， ZnO NPs和ZnSO4·7H2O對小麥根的抑制率Fig. 8 Inhibition rates of ZnO NPs and ZnSO4·7H2O on wheat roots with or without filter paper

目前，雖然有很多文獻都報道了ZnO NPs對植物的毒性，如2007年Lin與Xing[27]報道了ZnO NPs對黑麥草的根長的抑制作用，2011年Du等[29]報道了ZnO NPs對小麥的生長的影響；2015年Watson等[21]報道了ZnO NPs對小麥的根長具有明顯的抑制作用。但是，這些研究都沒有對比分析ZnO NPs與種子的發(fā)育階段的關(guān)系，只有Jian等[30]在2017年研究了包括小麥在內(nèi)的3種植物種子的種皮形貌對ZnO NPs毒性的影響，他們認為相對于西紅柿和狼尾草，小麥的種皮有很多褶皺，因此更容易吸附ZnO NPs，這與我們前面的分析一致。

2.5 Zn2+離子的影響分析

Zn2+離子對小麥的致毒濃度為25 mg·L-1[31-32]，根據(jù)已有研究來看，濃度在2 000 mg·L-1以下的ZnO NPs懸浮液中游離Zn2+的濃度都遠低于這一濃度。Shaymurat等[20]用ICP方法對濃度在10～50 mg·L-1的ZnO NPs懸浮液中游離Zn2+濃度進行了檢測，結(jié)果表明，其濃度僅為0.353～1.936 mg·L-1。Lin等[27]也報道了濃度為20～2 000 mg·L-1的ZnO NPs懸液中的游離Zn2+濃度為0.3～3.6 mg·L-1，且在此濃度范圍內(nèi)Zn2+離子并不對黑麥草造成毒性。由于本文所用的ZnO NPs的濃度為20～60 mg·L-1，其中的游離Zn2+離子不會對小麥種子的發(fā)育造成影響。為此，我們僅研究了較高濃度的游離Zn2+離子對小麥種子發(fā)育的影響，并與ZnO NPs進行了對比。

圖8是濃度為50 mg·L-1ZnO NPs懸浮液和濃度為176.6 mg·L-1ZnSO4·7H2O溶液(二者的Zn元素濃度均為40.2 mg·L-1)對小麥根長的抑制率。從圖中可以看到，在燒杯中不放濾紙情況下，ZnO NPs和ZnSO4·7H2O對小麥根長的抑制率分別為66.7%和90.6%。而在有濾紙的情況下，ZnO NPs對小麥根長的抑制率只有4.6%，但是ZnSO4·7H2O溶液對小麥根長的抑制率幾乎未受影響，仍然達到了88.4%。由于濾紙對ZnO NPs具有很強的吸附作用，會大大降低ZnO NPs的有效濃度，但其對Zn2+離子的濃度則幾乎沒有影響，這是造成上述差別的主要原因。從這里也可以看出，在本文所涉及的濃度范圍內(nèi)，ZnO NPs的毒性主要是由其自身的納米特性造成的。高濃度的Zn2+離子雖然也會對小麥具有毒性，但是其機理應(yīng)當是與ZnO NPs的致毒機理不同。

綜上可知：

(1) 粒徑為5 nm左右的氧化鋅納米顆粒(ZnO NPs)在水培條件下對處于吸脹階段、萌動階段和發(fā)芽階段的小麥種子都可以產(chǎn)生毒性。就萌動階段和發(fā)芽階段而言，ZnO NPs的毒性與其濃度有關(guān)，濃度越大毒性越大，即具有顯著的濃度效應(yīng)。

(2) ZnO NPs在水培條件下對小麥的毒性大小隨小麥種子發(fā)育階段的不同而表現(xiàn)出明顯的差異(P<0.05)。在發(fā)芽階段的毒性最大，在吸脹階段的毒性最小，在萌動階段的毒性介于兩者之間。

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