稀有鮈鯽作為水生模式生物的研究及探討

吳晟旻，張圣虎，吉貴祥，劉濟寧，石利利,*，周炳升

1. 環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，南京 210042 2. 中國科學院水生生物研究所，武漢 430072 3. 中國科學院大學，北京 100049

稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus Ye et Fu, 1983年)屬鯉科，鮈鯽屬，較廣泛地分布于我國四川省的成都平原及其西部邊緣地區(qū)，涉及岷江中游、沱江上游、大渡河中下游和青衣江中下游，是我國特有的小型魚類。稀有鮈鯽體型小、飼養(yǎng)簡便、卵膜透明、可周年產(chǎn)卵，符合水生模式生物培養(yǎng)對象的必要條件。本文旨在通過研究與分析，認知稀有鮈鯽與國際公認模式生物存在的差距，借鑒發(fā)達國家推動模式生物的實踐經(jīng)驗，為稀有鮈鯽成為水生模式生物找到一條切實可行的途徑。

1 稀有鮈鯽作為水生模式生物的意義(Significance of rare minnow as an aquatic model organism)

1.1 模式生物基本概念

模式生物(model organism)，其定義為一種動物由于其生物學特性，被認為能代表一個更大的生物群體，同時這種動物身上的其他特點使它更容易或更方便用于所代表動物的科學研究，從而成為模式生物。常見的模式生物有果蠅、爪蟾、斑馬魚、小鼠等。模式生物應具有以下幾種或全部特點[1-3]：

(1) 物種自身結(jié)構(gòu)包含了所代表生物類群的基本生物學過程；(2) 野外獲取容易，易于在實驗室條件下飼養(yǎng)繁殖；(3) 具有相對小而穩(wěn)定的基因組；(4) 生命周期短；(5) 研究方便和操作簡單；(6) 易于開展遺傳學分析；(7) 品系資源豐富(野生、突變、轉(zhuǎn)基因等品系)。

上述條件的第(1)、(2)、(3)、(4)條，有不少物種可以達到要求，但是第(5)、(6)、(7)條則需要通過長期的科研實踐和科技人員堅持不懈的努力才能達到。

1.2 模式魚種選擇

魚類作為模式生物已經(jīng)有近200年的歷史[4]。有記載最早使用的魚種是金魚，在19世紀中期歐洲將其用于水生毒理學研究[5]。隨著研究領(lǐng)域的擴大，魚種的選擇也在不斷豐富。目前常用魚類開展研究的領(lǐng)域有發(fā)育學、遺傳學、免疫學、毒理學、癌癥、基因組、轉(zhuǎn)錄組學等。試驗魚種的選擇也開始多樣化。然而研究用魚并不是科研人員隨便確定或隨機獲得的，而是經(jīng)過多年研究和反復選擇而得。近30年來，有不少魚種曾一度被認為是優(yōu)良模式生物，但隨著研究深入發(fā)現(xiàn)了許多限制條件而逐漸淘汰。例如，河豚魚由于其基因組大小只有300～400 Mb(為人類基因組的1/8左右)，但基因數(shù)目卻與人大致相當，被認為是十分理想的模式生物[6]，但由于在實驗室條件下繁殖養(yǎng)育困難，而逐漸褪去了模式生物的光環(huán)[7]。還有我國最常見的四大家魚，青魚、草魚、鰱魚、鳙魚。這些魚在我國分布廣泛，養(yǎng)殖和繁育也較為容易。但是由于它們體型大、性成熟周期長(3～5年)，也不適用模式生物[8]。因此，經(jīng)過多年的選擇和淘汰后，目前最常用的試驗魚種有斑馬魚(Danio rerio)、青鳉(Oryzias latipes)、虹鱒(Salmo gairdneri)、黑頭軟口鰷(Pimephales promelas)、金魚(Carassius auratus)和稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)等。圖1是4種常用魚種在部分學術(shù)領(lǐng)域發(fā)表文獻的數(shù)量情況。

圖1 4種常用魚種在部分學術(shù)領(lǐng)域發(fā)表文獻數(shù)量(截至2017年2月20日)Fig. 1 Number of publications in part of academic fields regarding some of commonly used fish species (until Feb. 20, 2017)

圖1結(jié)果顯示，從文獻總量來看，斑馬魚的文獻總量最為豐富，并遠大于其他3種魚文獻量的總和，4種魚文獻數(shù)量大小依次為斑馬魚>青鳉>金魚>稀有鮈鯽。從研究領(lǐng)域來看，斑馬魚在幾乎所有領(lǐng)域均是常見的研究魚種，金魚在研究氧化脅迫、免疫等領(lǐng)域[9-10]使用較多。青鳉在發(fā)育、遺傳等領(lǐng)域產(chǎn)出文獻較為豐富[11-12]。而稀有鮈鯽則在毒理學和發(fā)育領(lǐng)域研究相對較多[8,13]。此外，4種魚在發(fā)育、生長和繁殖這幾個涉及魚類基本生物學過程的領(lǐng)域加和產(chǎn)出的文獻數(shù)量約占文獻總量的50%，提示基本生物學過程研究是成為模式生物的重要基礎(chǔ)。

1.3 稀有鮈鯽作為水生模式生物的意義

我國是化學品研發(fā)、生產(chǎn)、使用和出口大國。各類化學品廣泛應用于我國生產(chǎn)和生活的各個領(lǐng)域，并通過多種途徑大量釋放進入環(huán)境[14]。魚類是水生態(tài)測試重要的受試生物，也是生態(tài)系統(tǒng)重要指示生物[15]。由于生態(tài)系統(tǒng)的敏感種和優(yōu)勢種具有非常強的地域特性[16]，使用我國本土魚種會比國際通用物種或西方典型魚種更能真實地反映化學品對我國本土生態(tài)系統(tǒng)的影響。另外，歐盟REACH法規(guī)規(guī)定所有在歐盟境內(nèi)生產(chǎn)或者進口到歐盟境內(nèi)大于1 噸·年-1化學物質(zhì)都需要向歐盟化學品管理署申報登記。美國、日本、韓國等也在修訂原有法規(guī)，將化學品安全性評估的責任主體轉(zhuǎn)移到企業(yè)。我國化學品出口企業(yè)必須按照國外法規(guī)使用當?shù)貒彝扑]魚種進行環(huán)境危害評估，這意味著我國企業(yè)將付出高昂的成本。因此，推動稀有鮈鯽成為國際公認的模式生物，對于保護本土生態(tài)系統(tǒng)，打破國外綠色貿(mào)易壁壘具有重要意義。

1.4 斑馬魚成為模式生物的實踐歷程

稀有鮈鯽和斑馬魚具有幾個相同的特征。個體小、養(yǎng)殖花費少，能大規(guī)模繁育，胚體透明，發(fā)育異常的畸形體很容易鑒定出來。此外，2種魚的精子均可通過冷凍來保存，給試驗操作和遺傳學分析提供極為有利的條件。然而這只是模式生物的基本要求。從斑馬魚成為模式生物的實踐歷程可以發(fā)現(xiàn)，它離不開發(fā)達國家科學家在20世紀80、90年代作出的突出貢獻。20世紀70年代，科研人員開始使用斑馬魚研究水環(huán)境污染問題[17]。1981年美國俄勒岡大學的George Streisinger教授在《Nature》上發(fā)表了關(guān)于如何開展斑馬魚人工雌核發(fā)育的文章[18]，為斑馬魚成為模式魚種開創(chuàng)了道路。20世紀90年代初期，美國俄勒岡大學的Wolfgang Driever、Mark Fishman教授和德國Christiane Nusslein-Volhard領(lǐng)導的團隊，在斑馬魚飽和誘變突變體篩選上取得了突破性進展[19-20]，數(shù)千尾突變體從德、美2家實驗室篩選出來[21]。第一個關(guān)于魚類的斑馬魚基因連鎖圖也被發(fā)表[22]。因此在當年，世界各地從事斑馬魚遺傳和發(fā)育研究的學者集會美國冷泉港進行了題為“Zebrafish Development and Genetics”的研討會將斑馬魚的研究推向了一個高潮。不久后，國際兩大科學雜志《Science》和《Nature》分別發(fā)表評論，認為斑馬魚已完全具備作為脊椎動物發(fā)育生物學甚至人類基因組計劃模式種的條件，是理想的模式生物。因此，研究斑馬魚成為模式生物的實踐歷程，對推進稀有鮈鯽作為水生模式生物具有重要參考意義。

2 稀有鮈鯽的生物生態(tài)學研究情況(Research situation on biology and ecology of rare minnow)

2.1 稀有鮈鯽生物學特性

稀有鮈鯽屬鯉科，鮈鯽屬。稀有鮈鯽較廣泛地分布于我國四川省的成都平原及其西部邊緣地區(qū)，涉及岷江中游、沱江上游、大渡河中下游和青衣江中下游。它是我國特有的小型試驗魚種[23-24]。稀有鮈鯽個體全長2～6 cm，一般情況下3個月左右即可產(chǎn)卵；繁殖溫度范圍在16～28 ℃之間；在控溫的條件下能夠?qū)崿F(xiàn)全年的周期性的繁殖[25]。稀有鮈鯽卵的直徑約為1.2～1.5 mm，較斑馬魚卵大；卵粒透明度比斑馬魚高，能夠清晰地觀察到胚胎發(fā)育的具體階段[26]。稀有鮈鯽體型小、生命力強、飼養(yǎng)簡便、不易染病、卵膜透明、繁殖季節(jié)長，人工控制條件下可周年產(chǎn)卵；性成熟快，產(chǎn)卵批次多，屬于連續(xù)產(chǎn)卵類型，符合模式動物培養(yǎng)對象的必要條件[27]。圖2顯示稀有鮈鯽的全生命周期，分為受精卵、胚胎期、卵黃囊階段、仔魚、幼魚和成魚6個階段。

2.2 稀有鮈鯽品系

經(jīng)過多年努力，我國科研人員建立了稀有鮈鯽近交系(HAN)和野生封閉群(IHB)2種品系。稀有鮈鯽近交系(HAN)是將稀有鮈鯽經(jīng)過長期的配對近交而得，微衛(wèi)星多態(tài)性分析表明近交系(HAN)體內(nèi)大多數(shù)為純合位點，遺傳多樣性明顯降低，為進行遺傳學分析和分子生物學研究提供了基礎(chǔ)[28]。野生封閉群是指不從外部引入新個體的條件下，已非近親交配方式至少繁殖4代以上的實驗動物群體。由于封閉群動物遺傳組成較接近于自然狀態(tài)下的群體結(jié)構(gòu)，遺傳上具有高度雜合性，遺傳特性保持相對穩(wěn)定，因此十分適合生態(tài)毒理研究[29-30]。

2.3 稀有鮈鯽生態(tài)毒理學研究

從1990年開始許多學者采用稀有鮈鯽進行生態(tài)毒理研究，證明稀有鮈鯽對外源化合物均有很高的敏感性，適合作為我國本土試驗魚種[13,30]。例如，中國科學院水生生物所對稀有鮈鯽的急、慢性毒性測試方法、參比物選擇等進行了研究，對比了稀有鮈鯽、劍尾魚和斑馬魚對金屬鉻和五氯酚的敏感性，驗證了稀有鮈鯽毒性測試方法[8]。中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心對稀有鮈鯽的內(nèi)分泌干擾特性做了較為系統(tǒng)的研究[31]，證明對于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，稀有鮈鯽是十分優(yōu)良的測試魚種。西南大學、同濟大學、武漢大學、華中農(nóng)業(yè)大學等多所高校研究了稀有鮈鯽在外源化合物暴露下，對分子基因、生理生化以及個體和種群效應的影響[32-34]。這些研究為稀有鮈鯽列入水生模式魚種奠定了良好基礎(chǔ)。

3 稀有鮈鯽應用領(lǐng)域和應用情況(Application field and application situation of rare minnow)

經(jīng)過我國幾代科研人員的努力，我們已經(jīng)有了純熟的稀有鮈鯽人工繁育技術(shù)、人工雌核發(fā)育技術(shù)、品系鑒定技術(shù)、染色體操作技術(shù)、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)等，具備了稀有鮈鯽胚胎發(fā)育學和細胞遺傳學基礎(chǔ)[35-38]。然而與模式魚種斑馬魚、青鳉相比較，稀有鮈鯽還在品系研究、標準制定、基因研究以及數(shù)據(jù)與資源保存等應用領(lǐng)域存在差距。

3.1 品系研究領(lǐng)域

稀有鮈鯽的品系主要有近交系(HAN)和野生封閉系(IHB)。目前近交系(30多代)已達到較高的近交程度，與野生種群相比遺傳多樣性明顯降低，為進行遺傳學分析和分子生物學研究提供了基礎(chǔ)[28]。野生封閉系則十分適合生態(tài)毒理研究[30]。但與模式魚種相比，稀有鮈鯽品系種類較少，突變和轉(zhuǎn)基因還未建立相關(guān)品系，制約了其對環(huán)境毒理的深入研究。例如，斑馬魚已建立約20個野生品系。其中常用的斑馬魚品系有AB品系、Tuebingen(Tu)品系、WIK品系。斑馬魚還保存有3 000多個突變品系和100多個轉(zhuǎn)基因品系(http://zebrafish.org)。這些品系資源對于利用斑馬魚開展各種科學研究起著很大的推動作用。青鱂也建立了10余個野生品系和近交系以及80多個突變系(http://mbase.nig.ac.jp)，同樣具備模式種的條件。

圖2 稀有鮈鯽全生命周期Fig. 2 Life circle of rare minnow

有鑒于此，有必要加強稀有鮈鯽品系培育和篩選，特別是大力構(gòu)建稀有鮈鯽轉(zhuǎn)基因品系和突變品系，為拓展稀有鮈鯽研究應用領(lǐng)域奠定堅實基礎(chǔ)。

3.2 標準制定領(lǐng)域

斑馬魚和青鳉是目前國外測試標準或指南中的主要推薦魚種。例如，斑馬魚和青鱂是國際標準化組織(ISO)推薦的毒性試驗材料魚(ISO 7346-1996)[39]，還是OECD魚類毒性試驗的推薦用魚(OECD TG 203)[40]。由于這2種魚具有繁殖快、飼養(yǎng)管理方便、取材容易等特點，是魚類毒性試驗較理想的對象。稀有鮈鯽同樣具備上述特性。目前我國正陸續(xù)研究制定使用稀有鮈鯽的相關(guān)測試標準與規(guī)范。例如，已制定發(fā)布了化學品稀有鮈鯽急性毒性試驗(GB/T 29763—2013)、化學品魚類急性毒性試驗(GB/T 27861—2011)、化學品魚類胚胎和卵黃囊階段短期毒性試驗(GB/T 27807—2008)、化學品魚類幼體生長試驗(GB/T 27806—2008)、化學品魚類早期生活階段毒性(GB/T 21854—2008)等標準和規(guī)范均推薦使用稀有鮈鯽作為測試魚種[41-45]。此外，還有多個關(guān)于稀有鮈鯽的毒性試驗標準正在制定中。2004年我國環(huán)境保護部將稀有鮈鯽作為推薦測試魚種，為我國新化學物質(zhì)登記提供了大量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[46-47]。然而隨著化學品環(huán)境研究的不斷深入，基于全生命周期的胚胎毒性、繁殖毒性、發(fā)育毒性及內(nèi)分泌干擾效應等慢性生物毒性測試方法發(fā)展迅速，化學品環(huán)境危害性的內(nèi)涵在不斷豐富與發(fā)展。以稀有鮈鯽急性毒性測試為主的化學品生態(tài)毒理測試技術(shù)已不能滿足發(fā)展的要求。

因此，亟需制定稀有鮈鯽質(zhì)量標準、飼養(yǎng)管理標準，建立稀有鮈鯽基于發(fā)育毒性、胚胎毒性、繁殖毒性和內(nèi)分泌干擾效應的測試標準，以滿足化學品測試技術(shù)的發(fā)展要求。

3.3 基因研究領(lǐng)域

稀有鮈鯽在基因研究方面與斑馬魚和青鳉還存在較大差距。雖然稀有鮈鯽的基因研究也在不斷深入[36-37,48]，但總體還處在起步階段，難以形成體系。而斑馬魚和青鳉已完成了基因組測序，并在此基礎(chǔ)上建立了較為完整的基因表達、基因功能的研究方法[49-50]。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，還可以方便快捷地建立各類突變品系和轉(zhuǎn)基因品系用于各種研究目的[51-52]。例如，轉(zhuǎn)基因斑馬魚含有特定污染物的效應元件結(jié)合的報告基因，當水體中含有特定環(huán)境污染物時，基因被激活并與報告基因共同表達，使魚體呈現(xiàn)熒光，并可根據(jù)熒光的強度來表征特定污染物的濃度。斑馬魚中關(guān)鍵的性別分化基因分別是負責雌性分化的基因(fig-а, cyp1a9)和負責雄性分化的基因(ar, sox9a, dmrt1)[53-55]。青鳉的性別決定基因也已被探明，雄魚Y染色體上Dmy是啟動精巢發(fā)育的決定基因，已被用于性分化測試中的性別鑒定[56]。

因此，亟待加強稀有鮈鯽分子生物學的深入研究。開展稀有鮈鯽基因組測序，建立稀有鮈鯽基因表達、基因功能的研究方法，特別是加強關(guān)鍵基因組功能(如性別鑒定基因、生長發(fā)育基因)的研究。

3.4 數(shù)據(jù)和資源保存領(lǐng)域

稀有鮈鯽目前還沒有建立數(shù)據(jù)和資源保存中心，相關(guān)的數(shù)據(jù)分散在各種專業(yè)文獻和數(shù)據(jù)庫中。而斑馬魚目前是模式生物數(shù)據(jù)與資源保存的典范。國際斑馬魚資源中心(ZIRC，美國)負責已有斑馬魚品系和相關(guān)研究資源收集、保藏和分享。國際斑馬魚基因數(shù)據(jù)庫ZFIN(http://zfin/org)里收集了所有關(guān)于斑馬魚的基因組測序以及功能基因的相關(guān)數(shù)據(jù)可供查詢、下載和研究。主要包括基因圖譜信息、斑馬魚所有已知基因、分子標記、各種克隆等。青鳉也建立了網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)資源，保存了大量突變系和基因組測序等一系列分子生物學資料，Medaka Genome Database (http://mbase.nig.ac.jp)(青鳉數(shù)據(jù)庫，日本)供研究者下載。

鑒于稀有鮈鯽在此領(lǐng)域存在的巨大差距，我國亟需建立稀有鮈鯽數(shù)據(jù)庫，搜集稀有鮈鯽相關(guān)文獻、基因信息、品系信息、形態(tài)解剖信息等。收集研究者提交的新品系、基因、克隆等信息。為研究者提供上述各類信息的檢索服務(wù)，從而推進對稀有鮈鯽的深入研究。

表1 稀有鮈鯽和模式魚種斑馬魚、青鱂的比較Table 1 Comparison of Gobiocypris rarus, Danio rerio and Oryzias latipes

4 結(jié)語(Conclusion)

稀有鮈鯽是一種優(yōu)良的試驗用魚，被我國環(huán)境保護部列為新化學物質(zhì)測試推薦魚種。本文對稀有鮈鯽成為水生模式生物進行了研究探討，表明稀有鮈鯽具備成為水生模式生物的必要條件。雖然與模式生物斑馬魚、青鳉對比，稀有鮈鯽仍存在不足和差距，但文中對此提出了針對性的建議。目前，我國關(guān)于稀有鮈鯽的研究正在不斷深入，職能管理部門及科研人員對其的關(guān)注和重視程度也在不斷提高。故而稀有鮈鯽作為本土物種一旦成為國際公認的模式生物將具有極其重要的意義。

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