實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用

陳 曦

1 PCR技術(shù)的基本原理

PCR擴(kuò)增即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，是在體外特異性地?cái)U(kuò)增某個(gè)基因的方法。在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，可以通過(guò)凝膠電泳的方法對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，也可以通過(guò)放射性核素?fù)饺霕?biāo)記后的光密度掃描來(lái)進(jìn)行定量的分析。無(wú)論定性還是定量分析，分析的都是 PCR 終產(chǎn)物[1]。但是在很多研究中感興趣的是未經(jīng)PCR 信號(hào)放大之前的起始模板量。例如想知道某一轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量。在這種需求下熒光定量 PCR 技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，可通過(guò)監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而繪制成一條熒光擴(kuò)增曲線。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的熒光檢測(cè)

可用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的熒光化學(xué)方法多種多樣，主要分為特異性的雜交探針和非特異性的熒光染料。雜交探針?lè)椒ㄐ柙O(shè)計(jì)與靶序列特異雜交的探針，并標(biāo)記特殊熒光，如分子信標(biāo)和Taqman等。非特異性的熒光染料則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的增加，如DNA結(jié)合染料SYBR-Green I。探針類(lèi)由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但成本較高，且探針與模板結(jié)合有一定的要求（PCR反應(yīng)溫度、反應(yīng)液組成等）[2]。熒光染料法價(jià)格低廉，簡(jiǎn)單易行。SYBR-Green I是目前最為常用的熒光染料，其作用原理為：SYBR-Green I是一種只與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料，并不與單鏈DNA鏈結(jié)合，而且在游離狀態(tài)不發(fā)出熒光，只有摻入DNA雙鏈中才可發(fā)光。因此，在PCR系統(tǒng)中，隨著特異性PCR產(chǎn)物的指數(shù)擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)的延伸階段，染料摻入雙鏈DNA中，其熒光信號(hào)強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)，可以對(duì)目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量，同時(shí)還可以測(cè)定擴(kuò)增的目的DNA片段的融解溫度。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的定量方法

絕對(duì)定量方法：獲得的結(jié)果為起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常利用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知樣本的量。選擇合適的已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，系列稀釋后作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)和反應(yīng)獲得的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。絕對(duì)定量的前提是要有一組穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品，可以是含有目的基因的質(zhì)粒DNA，也可以是比擴(kuò)增片段長(zhǎng)的純化PCR產(chǎn)物，但前提是所有的作為標(biāo)準(zhǔn)品的核酸都必須保證穩(wěn)定。但由于標(biāo)準(zhǔn)品和目的基因不在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增，所以無(wú)法檢測(cè)也不能補(bǔ)償可能出現(xiàn)的目的基因反應(yīng)體系中的影響因素。

常用的相對(duì)定量計(jì)算方法是比較Ct法。使用該方法進(jìn)行基因表達(dá)定量時(shí)，來(lái)自于同一樣品的目的基因和內(nèi)參基因都要進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，其結(jié)果由目的基因與內(nèi)參基因Ct之間的差值ΔCt來(lái)反應(yīng)。比較常用的有2-ΔΔCt方法[3]。

目前實(shí)時(shí)熒光定量PCR已經(jīng)稱(chēng)為分子生物學(xué)科研領(lǐng)域的主要技術(shù)手段，極大地簡(jiǎn)化了核酸定量檢測(cè)的過(guò)程。自動(dòng)化操作提高了工作效率，反應(yīng)快速、重復(fù)性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果清晰。例如隨著生物芯片技術(shù)和熒光探針定量技術(shù)的結(jié)合，熒光定量PCR在醫(yī)學(xué)檢測(cè)及其他各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用前景將更加廣闊。

[1] 陳莊，鄧存良，吳剛.分子生物學(xué)基本技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].科學(xué)出版社，2015.23-25.

[2] 魏群.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].高等教育出版社，2015.48-55.

[3] 葉棋濃.現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)及實(shí)驗(yàn)技巧[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2015.176-179.