高效液相色譜法測(cè)定不同品種辣椒藥材中辣椒堿的含量

鄭創(chuàng)欽

【摘要】 目的：探討不同品種辣椒藥材中辣椒堿的含量的測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱選擇Hanbon Sci.& Tech.Lichrospher C18（250.0×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行分離，流動(dòng)相為甲醇：0.1%磷酸水溶液（65%～90%，0～45 min）梯度洗脫，檢測(cè)波長為280 nm，柱溫為28 ℃。結(jié)果：辣椒堿的線性回歸方程為：Y=11.918×106X-3.925×103（r=0.9997），辣椒堿在1.0007～4.0261 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，辣椒堿的平均回收率為99.93%，RSD=1.32%。結(jié)論：高效液相色譜法用于測(cè)定辣椒中辣椒堿的含量，成分分離效果好，系統(tǒng)穩(wěn)定性高，操作簡單，同時(shí)適用于不同品種辣椒藥材中辣椒堿的含量測(cè)定，不同品種不同成熟度的辣椒中辣椒堿的含量具有差異性。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法； 不同品種； 辣椒； 辣椒堿

【Abstract】 Objective：To study the method for the determination of capsaicin in different varieties of capsicum.Method：High performance liquid chromatography was used，and the separation was carried out on a Hanbon Sci. & Tech. Lichrospher C18 （250.0×4.6 mm，5 m）.The mobile phase consisted of methanol：0.1% phosphoric acid aqueous solution （65%-90%，0-45 min） gradient elution， detection wavelength was 280 nm， and the detection wavelength was 28 ℃.Result：The linear regression equation of capsaicin was Y=11.918×106X-3.925×103（r=0.9997），and the capsaicin showed a good linear relationship in the range of 1.0007-4.0261 μg.The average recovery of capsaicin was 99.93%，and RSD=1.32%.Conclusion：High performance liquid chromatography （RP-HPLC） can be used to determine the content of capsaicin in capsicum， and it has good separation effect，high system stability and simple operation.It can be applied to the determination of capsaicin in different varieties of capsicum.The content of capsaicin in different varieties of different maturity is different.

【Key words】 High performance liquid chromatography； Different varieties； Pepper； Capsaicin

First-authors address：Qiaoli Traditional Chinese Medicine Hospital of Doumen District in Zhuhai City（Second Traditional Chinese Medicine Hospital in Zhuhai City），Zhuhai 519125，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.04.006

辣椒（Capsicum frutescence L）又稱辣角、辣子、秦椒、番椒，屬于茄科辣椒屬植物[1]，起源于南美洲的秘魯和中美洲的墨西哥一帶，在大約十六世紀(jì)末期辣椒傳入中國，被作為藥物的調(diào)味品使用[2]。辣椒傳入我國之后其分布地區(qū)較廣，品種多，應(yīng)用范圍廣，具有一定的藥用價(jià)值[3]。《中國藥典》2010版（一部）將其作為新增品種進(jìn)行規(guī)定，并通過了高效液相色譜法測(cè)定辣椒堿成分的含量以控制辣椒的質(zhì)量。有研究表明，辣椒產(chǎn)生辣味的主要成分為辣椒堿，辣椒果實(shí)中的主要藥用成分也是辣椒堿，辣椒堿類化合物具有鎮(zhèn)痛、消炎、殺菌的作用，已經(jīng)被應(yīng)用于治療風(fēng)濕、跌打損傷、鎮(zhèn)痛、糖尿病性神經(jīng)痛以及銀屑病等疾病中[4-6]。本研究為了評(píng)價(jià)不同品種辣椒藥材的質(zhì)量，以辣椒中的有效成分辣椒堿為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法對(duì)不同品種辣椒藥材中的成分含量進(jìn)行了測(cè)定，為辣椒藥材的應(yīng)用和質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)為從植物資源中提取辣椒堿類物質(zhì)提供檢測(cè)依據(jù)[7]。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Agilent HP 1200型高效液相色譜儀器（其中包括四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測(cè)系統(tǒng)，均屬于美國Agilent公司生產(chǎn)）[8]，美國梅特勒BP-211D電子分析天平（精密度為0.0001 g），KQ5400型超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)），DHG-9275B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（北京生物科技有限公司），SB-2200EYE型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器（上海愛郎儀器有限公司）。

1.2 試藥 試驗(yàn)中的不同辣椒藥材購于本市農(nóng)科院，并經(jīng)相關(guān)專家鑒定為辣椒正品，將藥材曬干、粉碎，置于干燥容器內(nèi)備用[9]。對(duì)照品辣椒堿（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111666-201005），甲醇溶液，乙腈，磷酸溶液均為色譜純（北京化工科技有限公司），95%的乙醇溶液為藥用級(jí)別，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的配制 取同一批次的辣椒藥材約30 g，粉成粗粉后取12 g精密稱定后，置于500 mL的圓底燒瓶中[10]，加入藥材體積9倍量的95%乙醇溶液，搖勻后放置于60 ℃恒溫水浴鍋上減壓回流提取2.5 h后過濾，殘?jiān)Q重后加入2倍量的95%乙醇溶液按照上述操作方式提取1次，將2次濾液合并后加入95%乙醇溶液定溶至216 mL，過0.45 μm的微孔濾膜，置于容量瓶-20 ℃冰箱中，儲(chǔ)存，備用。

2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取辣椒堿對(duì)照品12.57 mg，置于25 mL的容量瓶中，加入95%的乙醇溶液定溶至刻度，搖勻后將不足的液體補(bǔ)充至刻度，得到0.503 mg/mL的辣椒堿對(duì)照品溶液[11]，置于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜條件的選擇 采用高效液相色譜法，色譜柱選擇Hanbon Sci.& Tech.Lichrospher C18（250.0×4.6 mm，

5 μm）進(jìn)行分離[12]，流動(dòng)相為甲醇：0.1%磷酸水溶液（65%～90%，0～45 min）梯度洗脫，檢測(cè)波長為280 nm，柱溫為28 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。分別取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液和2.1項(xiàng)下的供試品溶液各20 μL，按照上述色譜條件，分別連續(xù)進(jìn)樣3次，辣椒堿和供試品樣品中相鄰色譜峰的分離度>1.5，以辣椒堿峰計(jì)算理論塔板數(shù)>4000。記錄色譜圖，見圖1～2。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中[13]，用95%乙醇溶液稀釋并定溶至刻度后得到不同濃度的辣椒堿對(duì)照品溶液。分別吸取不同濃度的對(duì)照溶液各20 μL，按照2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：Y=11.918×106X-3.925×103（r=0.9997），辣椒堿在1.0007～4.0261 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度考察 取2.2項(xiàng)下的辣椒堿對(duì)照品溶液，按照2.3項(xiàng)下的色譜條件，每次進(jìn)樣20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰面積并按照線性回歸方程計(jì)算，結(jié)果表明辣椒堿對(duì)照品平均色譜峰面積為135697，其RSD值為1.23%，表明所采用的高效液相色譜儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性考察 取同一批次的供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、16、20 h內(nèi)按照2.3項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，結(jié)果表明辣椒堿的平均峰面積為406 289，RSD值為1.02%，表明辣椒供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取統(tǒng)一品種的辣椒樣品6份，按照2.1項(xiàng)下的供試品溶液配制方法制備成待測(cè)樣品溶液，按照2.3項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定辣椒堿含量[14]，結(jié)果表明辣椒堿的平均含量為1.326 mg/g，RSD值為0.32%，表明高效液相檢測(cè)方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批次樣品6份，精密稱定，分別精密加入已知濃度的辣椒堿對(duì)照品溶液（辣椒堿含量為0.503 mg/mL）1.0、1.0、2.0、2.0、4.0、4.0 mL，按照2.1項(xiàng)下的供試品溶液的制備方法配制成溶液后[15]，按照2.3項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，按照線性回歸方程進(jìn)行分析，辣椒堿的加樣平均回收率為99.93%，RSD值為1.32%，見表1。

2.9 樣品含量測(cè)定 取不同省份的辣椒藥材樣品，按照2.1項(xiàng)下的制備溶液方法制備成供試品溶液，取已知濃度含量的辣椒堿對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL[16]，注入高效液相色譜儀器中按照2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，按照線性關(guān)系方程計(jì)算不同省份辣椒樣品中辣椒堿的含量。由表2～3可以看出，不同地區(qū)和不同品種的辣椒中辣椒堿的含量具有一定的差異性。表2可知四川產(chǎn)的四川辣椒王中辣椒堿的含量與其他省份比較含量相對(duì)較高。由表3數(shù)據(jù)可知，辣椒籽中辣椒堿的含量明顯低于辣椒皮中辣椒堿的含量。

3 討論

辣椒堿類化合物是辣椒果實(shí)品質(zhì)以及中藥材的重要指標(biāo)[17]，本文通過試驗(yàn)建立了高效液相色譜法測(cè)定辣椒中辣椒堿的方法，方法操作簡單，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可以作為辣椒原料的質(zhì)量控制方法。

3.1 流動(dòng)相的選擇 本研究中按照有關(guān)的參考文獻(xiàn)[18]采用了甲醇-水-磷酸溶液（75：25：0.1）作為高效液相色譜試驗(yàn)的流動(dòng)相條件進(jìn)行梯度洗脫，色譜圖顯示，在上述流動(dòng)相條件下，辣椒中的辣椒堿與其另外一種成分二氫辣椒堿的色譜峰分離狀況不好，在改變色譜條件的流速以及樣品的預(yù)處理方面進(jìn)行改進(jìn)后分離效果也不理想，因此對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了改進(jìn)，甲醇：0.1%磷酸水溶液（65%～90%，0～45 min）梯度洗脫，得到了較好的分離效果。

3.2 檢測(cè)波長的選擇 本次試驗(yàn)開始前制備了已知濃度含量的辣椒堿對(duì)照品溶液和同一產(chǎn)地批次的辣椒中藥材，按照供試品溶液的制備方式配制成供試品溶液，采用95%的乙醇溶液作為空白對(duì)照組，置于紫外-可見分光光度計(jì)中，在波長為220～440 nm處進(jìn)行波長掃描[19]，結(jié)果顯示在280 nm處對(duì)照品及供試品溶液均有最大的吸收波長，因此選擇280 nm作為試驗(yàn)的檢測(cè)波長。

本次試驗(yàn)方法對(duì)不同產(chǎn)地不同品種的辣椒藥材進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示四川產(chǎn)的四川辣椒王與其他產(chǎn)地的辣椒藥材比較，辣椒堿的含量相對(duì)較高，同時(shí)對(duì)這一產(chǎn)地的辣椒中辣椒籽和辣椒皮進(jìn)行含量的比較，結(jié)果顯示辣椒堿在辣椒皮中的含量最高，說明辣椒堿主要存在于辣椒皮中[20]。

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（收稿日期：2016-12-29） （本文編輯：周亞杰）