禽腺病毒Ⅰ群的研究現(xiàn)狀

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(1.北京天之泰生物科技有限公司北京100194；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所甘肅蘭州730050）

禽腺病毒Ⅰ群的研究現(xiàn)狀

王亞楠1，韓濤1，李純玲1，劉中奇1，宋楠1，劉瑞鑿1，雷娜1，吳培星1，2*

(1.北京天之泰生物科技有限公司北京100194；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所甘肅蘭州730050）

近年來，全國各地相繼暴發(fā)禽腺病毒I群疾病，給養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。本文將從病原學(xué)、流行病學(xué)、病毒的分離培養(yǎng)、診斷技術(shù)及預(yù)防等方面對該病的研究現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)。

腺病毒；禽；研究現(xiàn)狀

禽腺病毒（Fowl adenovirus,FADV）屬于腺病毒 科，根據(jù)群特異性抗原的不同，分為三個(gè)群，分別是Ⅰ亞群、Ⅱ亞群和Ⅲ亞群。禽腺病毒Ⅰ群(Fowl adenovirus group I,FADV-I)具有共同的群抗原，共12個(gè)血清型，普遍存在于雞、鴨、鵝體內(nèi)，一些血清型在肉雞、野雞、火雞、鴿子、鸚鵡、長尾鴨、獵鷹中也有發(fā)現(xiàn)。臨床主要表現(xiàn)為包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis,IBH）、心包積液綜合癥(hydropericardium syndrome,HPS)和肌胃糜爛癥(adenoviral gizzard erosion，AGH)。禽腺病毒Ⅱ群可引起火雞出血熱和雉雞大理石脾病，禽腺病毒Ⅲ群僅引起減蛋綜合征。在免疫學(xué)上，禽腺病毒I群能夠誘導(dǎo)已感染的禽類產(chǎn)生高水平的中和循環(huán)抗體，并可在局部黏膜系統(tǒng)長期復(fù)制并持續(xù)少量排毒。

1 病原學(xué)

禽腺病毒I群粒子直徑70～90 nm，沒有囊膜，呈二十面體對稱，病毒粒子具有252個(gè)殼粒，240個(gè)非頂角殼粒為六鄰體(hexon)，12個(gè)頂角殼粒為五鄰體（penton），每個(gè)五鄰體有2條纖維(fiber)突起（見圖1）。病毒粒子在感染細(xì)胞核內(nèi)常呈晶格狀排列。

禽腺病毒I群核酸為雙股DNA，占整個(gè)病毒粒子的11.3%～13.5%，其余部分為蛋白質(zhì)。hexon、penton和fiber是FADV-I的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成了病毒的核衣殼；非結(jié)構(gòu)蛋白包括E1A、E1B、ADP (E3)、E4、pol、DBP（E2A)、pIVaII、52/55K、EP、100K、33K等。

禽腺病毒I群耐酸，故能通過胃腸道而繼續(xù)保持活性，許多禽腺病毒I群就是從動(dòng)物的糞便中獲得的。無囊膜，對有機(jī)溶劑不敏感，但在丙酮中不穩(wěn)定，在0.1%的甲醛中可被滅活。在-20℃時(shí)可長期存活，對熱的穩(wěn)定性有差異。適宜pH為5-6，pH值在2以下或10以上均不穩(wěn)定。

圖1 禽腺病毒I群的結(jié)構(gòu)示意圖

2 流行病學(xué)

FADV-I病毒呈世界性分布，各個(gè)年齡段家禽均易感。病禽可以同時(shí)感染多個(gè)血清型，也可以在擁有某個(gè)血清型病毒抗體的同時(shí)還可以排出另外一個(gè)血清型的病毒。FADV-I病毒多數(shù)在禽體內(nèi)復(fù)制但不致病，或只是引起較輕微的癥狀，當(dāng)有免疫抑制病或發(fā)生混合感染時(shí)，加劇病情的惡化，影響禽群健康。某些FADV-I本身具有致病性，如雞包涵體肝炎、心包積液和肌胃糜爛癥等。

2.1 包涵體肝炎（IBH）

該病于1963年首次在美國發(fā)生，隨后在世界各地相繼發(fā)生，現(xiàn)已流行于亞、非、拉、美世界各國。我國于1976年首先在臺(tái)灣省發(fā)現(xiàn)該病，1980年以后我國遼寧、河北、山東、內(nèi)蒙古呼和浩特市區(qū)先后有該病發(fā)生的報(bào)道。IBH現(xiàn)已成為一種嚴(yán)重危害我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的傳染病。

在禽腺病毒I群的12個(gè)血清型中，能引起雞包涵體肝炎的多見于血清l、2、3、4、5、7、8、10型，中國流行的包涵體肝炎的主要為 FAdV-8b和FAdV-11，以發(fā)病迅速、病程短、死亡率高，批次發(fā)病特點(diǎn)明顯為特征。病雞以貧血和出血性黃肝病為主要病變。在顯微鏡下，在肝細(xì)胞的細(xì)胞核中，可檢測到嗜堿性或嗜酸性包涵體。

2.2 心包積液綜合征（HPS）

該病于1987年在巴基斯坦臨近卡拉奇的安哥拉首先報(bào)道，因此又稱“安卡拉病”(Angrara disease)。我國于2014年江蘇省暴發(fā)該病，死亡率高達(dá)50%，2015年以來，東北、河北、河南等不少地區(qū)頻繁出現(xiàn)，目前已呈全國性流行趨勢，主要集中在在山東、河南、江蘇三省。

該病主要有FADV-I中的血清4型引起，以心包積液、肺水腫、肝壞死、胸腺和法氏囊萎縮為主要特征。顯微鏡觀察顯示，肝細(xì)胞中有嗜堿性包涵體。

2.3 肌胃糜爛癥（AGE）

1993年報(bào)道了砂囊糜爛是由FADV-I引起的，在日本，AGE在肉雞中引起了兩次暴發(fā)，無任何臨診癥狀，但剖檢發(fā)現(xiàn)肌胃黏膜壞死，在肌胃變質(zhì)的上皮細(xì)胞核內(nèi)存在包涵體。到目前為止，報(bào)道都來自于日本，且除了確診一例血清8型的感染外，絕大多數(shù)的分離株為血清1型。

FADV-I既可通過種蛋垂直傳播病毒，也可以通過污染的飼料、飲水或排泄物特別是糞便而直接或間接接觸而水平傳播，但以垂直傳播為主。兩種傳播方式結(jié)合使得病毒可以快速地呈現(xiàn)放射樣的傳播，特別是養(yǎng)殖模式比較復(fù)雜、養(yǎng)殖品種多樣、養(yǎng)殖管理粗放等情況下，發(fā)病會(huì)更嚴(yán)重。

3 病毒的分離培養(yǎng)

3.1 雞胚培養(yǎng)法

FADV-I可以在雞胚繁殖。常用的雞胚接種途徑有3種：卵黃囊接種，絨毛尿囊膜接種，尿囊腔接種。通過絨膜尿囊膜途徑接種較尿囊腔接種可分離到病毒，通常引起雞胚充血或出血、胚體潮紅、發(fā)育不良、甚至出現(xiàn)侏儒胚，胚體蜷曲、肝蒼白和脾腫大、絨毛尿囊膜增厚等特征。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)法

大多數(shù)腺病毒具有嚴(yán)格的宿主范圍，因此，往往用該病毒宿主動(dòng)物來源的細(xì)胞來分離病毒，因?yàn)檫@種細(xì)胞對這種病毒是最敏感。如果是從雞中分離FADV-I，可以接種原代雞胚肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)FADV-I，但成纖維細(xì)胞不引起細(xì)胞病變，雞胚肝細(xì)胞和腎細(xì)胞均有病變，如細(xì)胞變圓，折光性增強(qiáng)，細(xì)胞間隙距離增大，呈拉網(wǎng)狀，最后脫落等特征，并且有研究表明對于該病毒雞胚肝細(xì)胞培養(yǎng)法優(yōu)于雞腎細(xì)胞培養(yǎng)法的。

4 診斷技術(shù)

4.1 抗原檢測

近年來，隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，為臨床病原體的檢測提供了一種快速、敏感、高效的檢測方法，并與其他技術(shù)相結(jié)合，被逐步用于FADV-I的快速診斷，為該病的分子研究奠定的良好的基礎(chǔ)。

4.1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）2013年，索南卓瑪在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，根據(jù)禽腺病毒I群六鄰體基因的保守序列設(shè)計(jì)2對引物，建立了FAVI的通用套式PCR檢測方法，提高了常規(guī)PCR的特異性和敏感性。

4.1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和限制性長度多態(tài)性（PCR-RELP）PCR與限制性長度多態(tài)性具有快速、簡單、特異、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，可作為I群禽腺病毒流行毒株血清型的快速分型工具。

2009年，唐煜等人通過擴(kuò)增I群禽腺病毒Hexon基因A片段和B片段，并用限制性內(nèi)切酶HaeⅡ?qū)ζ溥M(jìn)行了酶切，通過對圖譜的分析可以對禽腺病毒I群的12個(gè)血清型進(jìn)行鑒定。

4.1.3 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTFQ PCR）SYBR Green I熒光PCR方法是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。與傳統(tǒng)方法相比，該方法操作簡單、耗時(shí)短、成本低，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

2008年，文艷玲等根據(jù)Genbank中禽腺病毒I群六鄰體基因的保守序列設(shè)計(jì)了1對引物，建立了檢測禽腺病毒I群12個(gè)血清型的SYBR Green I熒光PCR方法，可在5 h左右作出定性和定量的檢測和鑒定。

4.1.4 斑點(diǎn)雜交診斷法（Dot blot）斑點(diǎn)雜交是指將DNA或RNA樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維素濾膜上，然后與核酸探針分子雜交，以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。

2010年，朱后順建立斑點(diǎn)雜交的方法，該方法有利于病料的批量化檢測，并且方便保證各個(gè)病料樣品處理后核酸的反應(yīng)條件保持一致，因此結(jié)果更加可靠，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性能夠得到保證，為實(shí)際生產(chǎn)中的檢測和實(shí)驗(yàn)室診斷提供了一種可以選擇的方法。

4.1.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測法（LAMP）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是一種新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù)，只需要在水浴鍋恒溫條件下便可高效擴(kuò)增出核酸，具有特異性高、靈敏性強(qiáng)、操作簡便等特點(diǎn)。

2010年，唐熠等人根據(jù)I群禽腺病毒Hexon基因保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)了一套特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物，建立了一種適用于I群禽腺病毒的LAMP快速檢測方法。

此外，已有研究用系統(tǒng)進(jìn)化分析法、DNA原位雜交和hexon基因L1區(qū)的高通量溶解曲線分析法來檢測I群禽腺病毒。

4.2 抗體檢測

對于FADV-I抗體的精確檢測，能夠確切的反映家禽的感染情況。ELISA技術(shù)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好并且能夠大批量檢測等特點(diǎn)，因此成為監(jiān)測FADV-I抗體的最佳方法，但是由于禽腺病毒I群具有群抗原性，通過包被抗原的方法難以將其進(jìn)行血清型的鑒定。

2011年，韋悠等人通過包被全病毒建立了兩種間接ELISA的方法，經(jīng)過試驗(yàn)證明這兩種方法均可以較好的進(jìn)行臨床應(yīng)用，但是過濾法-ELISA優(yōu)于蔗糖法-ELISA。

同年，羅思思通過分別包被兩種結(jié)構(gòu)蛋白hexon和penton和非結(jié)構(gòu)蛋白100K和33K構(gòu)建了兩種間接ELISA，這兩種方法可以來區(qū)分滅活苗免疫雞與野毒感染雞，了解該場是否存在FADV-I，為該病毒的凈化和消滅提供技術(shù)支撐。

目前，荷蘭Biochek公司已有商品化的免疫酶聯(lián)免疫試劑盒，并且該試劑盒已用于疫苗免疫的評(píng)估和臨床檢測。Biochek提供的數(shù)據(jù)顯示，種雞在產(chǎn)蛋前抗體轉(zhuǎn)陽，可以終止排毒，從而停止垂直傳播。腺病毒感染動(dòng)力學(xué)顯示，雛雞在8周齡進(jìn)行感染或者免疫，可以保證產(chǎn)蛋期間有高水平的中和抗體，并且使下一代雛雞獲得母源抗體。

2012年，Beatrice Grafl等人用該試劑盒對德國肉種雞場進(jìn)行抗體檢測顯示，開產(chǎn)后第5周急性感染FAdV-1后，雞群產(chǎn)蛋正常，但是孵化率嚴(yán)重下降。

2014年，Schachner等人用該試劑盒對分別免疫了fiber-1、fiber-2和hexon loop-1三種衣殼蛋白的雞群進(jìn)行抗體檢測顯示，重組的fiber-2蛋白可以作為疫苗的保護(hù)性免疫抗原來預(yù)防雞群心包積液-肝炎綜合征（HHS）。

同年，Kim等用該試劑盒檢測免疫FAdV-4型滅活油苗后的雞群，顯示該疫苗可以對禽腺病毒I群的多種血清型提供交叉保護(hù)。

5 疫苗

隨著禽腺病毒I群發(fā)生越來越廣泛，越來越嚴(yán)重，在很多國家，相關(guān)的疫苗和單克隆抗體已經(jīng)研發(fā)出來。

墨西哥、印度和巴基斯坦的商品化禽腺病毒I群滅活疫苗是用血清4型病毒研發(fā)的，偶有用血清8型研發(fā)的疫苗。到目前為止，只有澳大利亞使用活疫苗，其他國家和地區(qū)均使用滅活疫苗。

2015年，Hess等人申請了禽腺病毒的亞單位疫苗專利，該疫苗包含的纖維-2蛋白（FAdV-A和FAdV-C） 和纖維蛋白 （FAdV-B、FAdV-D和FAdV-E），用于預(yù)防禽類尤其是肉雞的心包積液-肝炎綜合征、包涵體肝炎和肌胃糜爛癥。

目前，我國已經(jīng)開始制備禽腺病毒I群的滅活疫苗。2016年，青島易邦研制出的雞新城疫、禽流感（H9亞型）、禽腺病毒（I群，4型）三聯(lián)滅活疫苗（La Sota株+YBF13株+YBAV-4株）獲得了“中華人民共和國農(nóng)業(yè)部獸用生物制品臨床試驗(yàn)批件”。

6 防治措施

1）加強(qiáng)飼養(yǎng)管理：做好衛(wèi)生消毒工作，防止病毒的水平感染；減少各種應(yīng)激因素及免疫抑制疾病，以提高機(jī)體自身抵抗力。

2）注重生物安全：引進(jìn)的種蛋和種雞進(jìn)行該病原檢測和凈化；選擇正規(guī)廠家的合格活疫苗產(chǎn)品，杜絕因其引進(jìn)禽腺病毒I群野毒。

3）對癥治療：給與保肝護(hù)腎的藥物，同時(shí)強(qiáng)心利尿，并應(yīng)給與抗生素，控制細(xì)菌繼發(fā)感染。

4）生物防控：疫苗預(yù)防是對該病最為有效的防控方法。有人用干擾素制劑、卵黃抗體、肝組織制成的組織疫苗等，亦取得了一定的效果?！?/p>

The Current Research Atatus of Fowl Adenovirus GroupⅠ

Wang Yanan1，HanTao1，Li Chunling1，Liu Zhongqi1，SongNan1，Liu Ruizao1，LeiNa1，Wu Peixing1，2*（1.Beijing Tian Tech Biotechnology Co.,Ltd,Beijing,100194；2.LanZhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of CAAS,LanZhou GanSu,730050）

In recent years,Fowl Adenovirus-Ⅰall over the country have outbreaks of for aquaculture caused great economic losses.This article will from the etiology,epidemiology,separation and culture techniques, diagnosis and prevention of virus and so on to summarize the research status of the disease.

Adenovirus;Chicken;The research status

（略）

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.1.037

*通訊作者：吳培星。