副豬嗜血桿菌PCR與熒光定量PCR檢測方法的建立與比較

（天津市動物疫病預(yù)防控制中心天津300402）

副豬嗜血桿菌PCR與熒光定量PCR檢測方法的建立與比較

張穎，王建春

（天津市動物疫病預(yù)防控制中心天津300402）

本試驗(yàn)以副豬嗜血桿菌的農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為準(zhǔn)繩，將常規(guī)PCR和熒光PCR試劑盒進(jìn)行比對試驗(yàn)，結(jié)果顯示，二者的特異性均為100%，其靈敏性，常規(guī)PCR達(dá)1×10-10稀釋度，熒光PCR達(dá)1×10-12稀釋度，后者是前者的100倍，且試驗(yàn)所需時間短，不需要電泳分析，減少核酸染料對人體及環(huán)境的污染，是一種安全可靠的檢驗(yàn)方法，對該病的確診及防控由重大意義。

常規(guī)PCR；熒光定量PCR；比對

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起的以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征的全身性疾病。該菌多與其它病原如豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒等混合感染，嚴(yán)重危害了斷奶仔豬和保育豬的健康，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

近年來，PCR以其快速、敏感、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于各種病原微生物的檢測。為了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)室對該病的檢測方法，現(xiàn)將運(yùn)用常規(guī)PCR和熒光PCR法對疑似副豬嗜血桿菌病進(jìn)行檢測，并對其特異性、靈敏性等進(jìn)行比對，結(jié)果報告如下：

1 材料和方法

1.1 樣品

1）副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CCVA3729）：購自中國獸醫(yī)微生物保藏中心；

2）金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存；

3）疑似樣品來源于臨床病例。

1.2 試劑

1）副豬嗜血桿菌核酸擴(kuò)增檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）購自廣州維柏鑫生物科技有限公司，批號：20160718；

2）副豬嗜血桿菌核酸檢測試劑盒購自廣州維柏鑫生物科技有限公司，批號：20160718；

3）Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自杭州博日生物科技有限公司，批號：20160601；

4）PCR擴(kuò)增試劑盒購自杭州博日生物科技有限公司，批號：20161001；

5）DNA Marker DL2000購自杭州博日生物科技有限公司；

6）TAE緩沖液購自上海百賽生物技術(shù)有限公司；7）瓊脂糖購自BIOWEST公司；

8）副豬嗜血桿菌干粉培養(yǎng)基購自招遠(yuǎn)拓普生物工程有限公司；

9）NAD購自招遠(yuǎn)拓普生物工程有限公司；10）牛血清購自四季青生物有限公司。

1.3 儀器

1）PCR擴(kuò)增儀購自TaKaRa公司；

2）實(shí)時熒光定量PCR、離心機(jī)均購自Thermo Fisher公司；

3）紫外凝膠成像儀購自美國伯樂；4）電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.4 引物

按照NY/T2417-2013中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《副豬嗜血桿菌PCR檢測方法》中設(shè)計(jì)的引物：F1：5'-TAT CGG GAG ATG AAA GAC-3'；F2：5'-GTA ATG TCT AAG GAC TAG-3'；Revx：5'-CCT CGC GGC TTC GTC-3'引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用高壓過的去離子水稀釋終濃度20μmoL/L。

1.5 相關(guān)溶液的配制

1.5.1 副豬嗜血桿菌培養(yǎng)基的制備副豬嗜血桿菌干粉培養(yǎng)基13.6 g溶于400 mL超純水中，加入營養(yǎng)瓊脂10 g，121℃滅菌25 min，冷卻到50℃左右，加入NAD 1 mL和新生牛血清20 mL，倒平皿，待凝固后倒置，培養(yǎng)24 h后無雜菌生長后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 副豬嗜血桿菌液體培養(yǎng)基制備副豬嗜血桿菌干粉培養(yǎng)基13.6 g，用超純水定容至400 mL，高溫滅菌，備用。使用前加過濾除菌的NAD和新生牛血清20 mL。

1.5.3 副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌液的制備將副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于1.5.2所述的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)壯，37℃培養(yǎng)24 h后，將菌液平鋪在1.5.2所述的培養(yǎng)基，37℃24 h后挑取單個菌落進(jìn)行鑒定，確定為副豬嗜血桿菌后，將菌液放2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 樣品的處理

1）無菌采集疑似病例肺臟病變部位。將組織剪碎，按1 g加入生理鹽水進(jìn)行研磨，收集混懸液于2 mL滅菌離心管內(nèi)離心15 min，棄上清。收集沉淀，用1 mL生理鹽水重懸；

2）將500μL腹水和500μL生理鹽水等體積混勻后，7 500 g離心20 min，棄上清，收集沉淀，用1 mL生理鹽水重懸；

3）將凍干的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌按常規(guī)方法復(fù)壯后，接種于營養(yǎng)肉湯，用于DNA的提?。?/p>

4）標(biāo)準(zhǔn)菌株將1.5.3所配制的菌液用于DNA提取。

1.7 DNA提取

按照Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。

1.8 反應(yīng)體系及條件

1）按照NY/T2417-2013中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《副豬嗜血桿菌PCR檢測方法》的反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5μL，dNTPs 4μL，F(xiàn)1和F2引物各0.5μL，Revx引物1μL，提取的DNA 2μL，無菌超純水36.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL。反應(yīng)條件：94℃變性3 min；94℃變性1 min，56℃退火45 sec，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

3）常規(guī)PCR試劑盒反應(yīng)體系：提取DNA 4μL，反應(yīng)液21μL。反應(yīng)條件：94℃2 min；94℃30sec，58℃30 sec，72℃30 sec，35個循環(huán)。

4）熒光定量PCR反應(yīng)體系：提取DNA 4μL，反應(yīng)液20μL，酶液1μL。反應(yīng)條件：95℃10 min；94℃15 sec，55℃30 sec，40個循環(huán)。

1.9 特異性試驗(yàn)

將副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌的DNA分別按照1.8（1、2、3）進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。

1.10 靈敏性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)菌株依次稀釋成1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、1∶107、1∶108、1∶109、1∶1010，分別提取DNA，分別按照1.8進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。

1.11 結(jié)果的判定

按行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量控制：陰性對照在1 090 bp不出現(xiàn)片段；陽性對照在1 090 bp出現(xiàn)片段。

按行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果判定：樣品在1 090 bp出現(xiàn)片段，判為陽性；樣品在1 090 bp未出現(xiàn)片段，判為陰性。

常規(guī)PCR的質(zhì)量控制：陰性對照在118 bp不出現(xiàn)片段；陽性對照在118 bp出現(xiàn)片段。

常規(guī)PCR的結(jié)果判定：樣品在118 bp出現(xiàn)片段，判為陽性；樣品在118 bp未出現(xiàn)片段，判為陰性。

熒光定量PCR的質(zhì)量控制：陰性質(zhì)控品無明顯擴(kuò)增曲線或無Ct值顯示；陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤32。

熒光定量PCR的結(jié)果判定：若擴(kuò)增曲線有明顯的對數(shù)增長且Ct值＞35，則判定樣品為陽性；若檢測不到樣品Ct值為陰性。

1.12 臨床樣品檢測

采自臨床疑似病例20份血樣，分別提取DNA，應(yīng)用常規(guī)PCR和熒光PCR兩種方法進(jìn)行檢測，并設(shè)立陰、陽性對照。比較兩種檢測方法的特異性和敏感性。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn)

利用NY/T2417-2013中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《副豬嗜血桿菌PCR檢測方法》（簡稱農(nóng)標(biāo)）、常規(guī)PCR、熒光PCR方法對副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（CCVA3729）、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌進(jìn)行檢測，分別進(jìn)行了特異性及重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和陽性對照為陽性，其它細(xì)菌均為陰性，表明副豬嗜血桿菌PCR試劑盒特異性為100%（見表1；圖1～3）。

2.2 靈敏性試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)菌株依次稀釋成1∶106、1∶107、1∶108、1∶109、1∶1010、1∶1011、1∶1012、1∶1013、1∶1014、1∶1015，分別提取DNA。利用 NY/T 2417-2013中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《副豬嗜血桿菌PCR檢測方法》（簡稱農(nóng)標(biāo)）、常規(guī)PCR、熒光PCR方法對提取的DNA進(jìn)行檢測，分別進(jìn)行了靈敏性及重復(fù)性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在熒光PCR實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增曲線圖可以看出，標(biāo)準(zhǔn)菌株1×10-12稀釋可以作為檢測的底線，即可以檢測最低量為1×10-12，而1×10-13稀釋的模板與陰性對照的擴(kuò)增曲線基本一致，說明1×10-13稀釋的模板擴(kuò)增后的熒光強(qiáng)度沒有達(dá)到閾值，因此，熒光PCR試劑盒靈敏度為1× 10-12稀釋的模板，而常規(guī)PCR的電泳結(jié)果顯示1× 10-11稀釋度就看不出條帶，其靈敏度為1×10-10，充分證明了前者靈敏性占絕對的優(yōu)勢，是常規(guī)PCR的100倍。（見表2，圖4-6）

圖1 農(nóng)標(biāo)PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果圖

圖2 常規(guī)PCR試劑盒特異性試驗(yàn)結(jié)果圖

圖3 熒光PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果圖

表1 農(nóng)標(biāo)、常規(guī)P C R、熒光P C R特異性試驗(yàn)結(jié)果比對表

2.3 臨床樣品檢測

將臨床疑似病例無菌采集20份血樣，利用常規(guī)PCR和熒光PCR分別進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示（見表3）常規(guī)PCR檢測方法的陽性率為60%（12/20），熒光PCR檢測方法的陽性率為75%（15/20）。

3 討論

隨著規(guī)?；i場的發(fā)展，副豬嗜血桿菌病成為近年來危害豬場的嚴(yán)重細(xì)菌病之一，發(fā)病率及危害程度呈逐年上升的趨勢，引起廣大養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)工作者的重視[1]。如何快速、準(zhǔn)確地診斷該病是控制該病的關(guān)鍵。細(xì)菌分離鑒定雖然是細(xì)菌病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是由于副豬嗜血桿菌的營養(yǎng)要求較為苛刻，較難分離培養(yǎng)[2]，因此該方法通常不作為主要的檢測診斷方法，血清學(xué)檢測只能作為豬群是否感染過副豬嗜血桿菌的診斷依據(jù)，而不能作為診斷該病的依據(jù)，在臨床診斷中，除了觀察豬群臨床癥狀、病理變化，還需借助分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行確診。

本研究利用熒光PCR試劑盒和常規(guī)PCR試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，副豬嗜血桿菌與金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌均無交叉反應(yīng)，證明這兩種試劑盒的特異性均為100%。就靈敏性而言，熒光PCR的達(dá)1×10-12稀釋度，而常規(guī)PCR達(dá)1×10-10稀釋度，證明熒光PCR的靈敏度是常規(guī)PCR的100倍，優(yōu)于常規(guī)PCR，且檢測速度快，結(jié)果判斷不需要借助電泳分析，大大節(jié)省了時間并降低了溴化乙錠等核酸染料對人體的致癌危險和環(huán)境的污染，是一種安全、快速的診斷方法，對于臨床上副豬嗜血桿菌病的確診及該病綜合防控等具有重要意義?！?/p>

[1] 于江,吳家強(qiáng),張玉玉,等.副豬嗜血桿菌熒光定量PCR檢測技術(shù)的建立與應(yīng)用[J].家畜生態(tài)學(xué)報,2010,31（4）：77-81.

[2] 羅寶正,王振全,薄清如,等.TaqMan探針熒光PCR檢測副豬嗜血桿菌方法的建立和應(yīng)用 [J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,27（6）：1367-1370.

Haemophilus parasuis PCR and Realtime Fluorescence Quantitative PCR Detection Method of Establishment and Comparison

ZhangYing，Wang Jianchun
（Animal disease prevention and control center,TianJin,300402）

in this experiment,deputy pig haemophilus agricultural standard as the criterion,to compare the conventional PCR and fluorescence PCR kits test,the results show that both the specificity of 100%,its sensitivity,conventional PCR 1 x 10-10dilution degrees,fluorescence PCR 1 x 10-12dilution degrees,which is 100 times of the former,and the test time is short,don't need electrophoresis analysis,reduce pollution,human health and the environment by nucleic acid dye is a kind of safe and reliable testing method,the disease diagnosis and prevention and control of great significance.

Conventional PCR；Fluorescence Quantitative PCR；Contrast

表3 臨床樣品檢測結(jié)果表

圖4 農(nóng)標(biāo)PCR靈敏度結(jié)果

圖5 常規(guī)PCR靈敏度結(jié)果

圖6 熒光PCR試劑盒靈敏度曲線

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.1.043