豬種布魯氏菌對4種常用新型消毒劑敏感性的研究

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（1.山東綠都生物科技有限公司山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院山東濱州256600；3.鄒平縣畜牧獸醫(yī)局山東濱州256600）

豬種布魯氏菌對4種常用新型消毒劑敏感性的研究

董炳梅1，楊麗梅2，張含俠3，呂素芳2，李峰2*

（1.山東綠都生物科技有限公司山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院山東濱州256600；3.鄒平縣畜牧獸醫(yī)局山東濱州256600）

為了確定常用新型消毒劑對布魯氏菌的殺菌/抑菌效果，本研究將聚維酮碘、戊二醛、戊二醛癸甲溴銨復(fù)方溶液、二氯異氰尿酸鈉4種常用消毒劑與定量B.suis混合均勻，分別作用3 min、10 min與30 min，取0.1 mL涂布于TSA培養(yǎng)基中進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；通過對不同消毒劑、不同作用時間其殺菌率的對比，確定不同消毒劑對B.suis的敏感程度。研究表明，B.suis對聚維酮碘溶液敏感性最強(qiáng)，10%聚維酮碘溶液1 000倍稀釋作用3 min便能有效殺滅B.suis；其次戊二醛與癸甲溴銨混合溶液效果顯著優(yōu)于戊二醛單獨(dú)使用，100倍稀釋后可有效殺滅B.suis，1 000倍稀釋后作用30 min可100%殺滅B.suis；而單獨(dú)使用戊二醛，僅在10倍稀釋時3～30 min能有效殺滅該菌，100倍稀釋時作用30 min，其殺菌率僅達(dá)93%；而二氯異氰尿酸鈉在4種消毒劑中消毒效果最不理想，其最高殺菌率僅為67%；因此，在布魯氏菌病的防控中，消毒劑以聚維酮碘與戊二醛癸甲溴銨復(fù)方制劑為最佳選擇。

布魯氏菌；消毒劑；敏感性；殺菌率

布魯氏菌是一種革氏陰性、小球桿狀菌，無鞭毛，不形成芽孢，毒力菌株可有菲薄的莢膜，對營養(yǎng)要求高，生長緩慢。牛、山羊、綿羊和豬為常見自然病例，多種動物對牛、羊、豬3種布魯氏菌以及同種布魯氏菌間均有一定的易感性[1-3]。布魯氏菌主要存在于病畜的乳汁、精液、膿汁、胎兒、胎衣、羊水、子宮陰道分泌物中，主要為經(jīng)皮膚黏膜接觸感染，經(jīng)消化道、呼吸道感染。其中，病畜及被污染的水、墊料、飼草、奶及肉制品等是重要的感染源[4]。研究發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌在外界適宜的條件下可生存很長時間，抗滅活能力強(qiáng)，在土壤中可存活4～120 d，在糞便中可存活8～125 d，尿液中可達(dá)4～150 d，水中可達(dá)50～120 d，陽光照射可存活7～8 d。由于該菌對濕熱、紫外線、以及常用消毒劑、抗生素和化學(xué)藥物較敏感，因此在對抗布魯氏菌病的過程中，環(huán)境、器具及廢棄物的消毒就顯得尤為重要。

消毒是在應(yīng)用消毒劑的基礎(chǔ)上，防控疾病傳播及流行的可靠方法，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有重要作用。消毒劑是指能殺滅傳播媒介上的微生物并達(dá)到消毒要求的制劑，一般含有一種或多種成分，雖然普遍具有廣譜性消毒效果，但對于細(xì)菌/病毒等病原的敏感性也具有一些差異[5]。因此，通過試驗(yàn)確定不同消毒劑的消毒效果便顯得尤為重要。為了確定常用消毒劑對布魯氏菌的敏感性，本研究比較了聚維酮碘、戊二醛、二氯異氰尿酸鈉等4種常用消毒劑對豬種布魯氏菌的殺滅作用，從而為更好的防控布魯氏菌提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬種布魯氏菌（Brucella.suis,B.suis）由山東綠都生物科技有限公司重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；Tryptone soya agar（TSA）購自O(shè)XOID公司；Tryptic soy broth（TSB）購自BD公司；綠都金典（聚維酮碘10%）、喜衛(wèi)酸（戊二醛5%+癸甲溴銨溶液5%）、綠都牧安（稀戊二醛5%）與二氯異氰尿酸鈉（45%有效氯）購自山東綠都安特動物藥業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 B.suis的培養(yǎng)將B.suis以1%比例接種于5 mL TSB培養(yǎng)基上，置于搖床上，37℃180 rpm培養(yǎng)16～24 h，收獲，置于4℃冰箱保存。

1.2.2 B.suis的菌落計(jì)數(shù)將上述B.suis的培養(yǎng)液進(jìn)行10-7、10-8、10-9稀釋，分別取0.1 mL接種與TSA培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)箱中60～72 h，觀察記錄各個平皿上的菌落數(shù)，依據(jù)稀釋倍數(shù)，計(jì)算每毫升原菌液所含細(xì)菌菌落總數(shù)。

1.2.3 B.suis對不同消毒劑敏感性試驗(yàn)將二氯異氰尿酸鈉（45%有效氯）配制為200 mg/L，并將其與綠都金典（聚維酮碘10%）、喜衛(wèi)酸（戊二醛5%+癸甲溴銨溶液5%）、綠都牧安（稀戊二醛5%）分別進(jìn)行10×、100×、1 000×與10 000×稀釋；依據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果將B.suis菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取0.1 mL菌液加入0.9 mL稀釋后的消毒液中混勻，分別作用3 min、10 min與30 min，最后取0.1 mL加入TSA培養(yǎng)基中；同時將菌液進(jìn)行10-8稀釋，取0.1 mL加入TSA培養(yǎng)基中，作為對照；置于37℃培養(yǎng)箱中60～72 h，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算每組的殺菌率。

2 結(jié)果

2.1 B.suis培養(yǎng)與菌落計(jì)數(shù)

按常規(guī)方法將B.suis加入TSB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，該菌液每單位菌落數(shù)為33×109CFU/mL。

2.2 B.suis對不同消毒劑敏感性試驗(yàn)

2.2.1 B.suis對綠都金典（聚維酮碘10%）敏感性試驗(yàn)將B.suis菌液進(jìn)行1×107倍稀釋，取0.1 mL菌液分別加入0.9 mL稀釋后的綠都金典（聚維酮碘10%）中混勻，作用3 min、10 min與30 min，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：對照組菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示為30×109CFU/mL；將該消毒液進(jìn)行10×、100×與1 000×稀釋后，與B.suis菌液作用 3～30 min，其殺菌率均能達(dá)到100%，證明可有效殺滅B.suis；但10 000倍稀釋后，雖然其殺菌率隨著與B.suis作用時間的延長而增高，但不能將B.suis徹底殺滅。（見表1）

2.2.2 B.suis對喜衛(wèi)酸（戊二醛5%+癸甲溴銨溶液5%）敏感性試驗(yàn)對照組菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示為30× 109CFU/mL；將B.suis菌液進(jìn)行1×107倍稀釋后，與喜衛(wèi)酸（戊二醛5%+癸甲溴銨溶液5%）分別作用3 min、10 min與30 min，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：將該消毒液進(jìn)行10倍與100倍稀釋后，與B.suis作用3～30 min，其殺菌率均至100%；當(dāng)進(jìn)行1 000倍稀釋時，作用3 min、10 min，其殺菌率分別為85.2%與92.6%，作用30 min，其殺菌率為100%；進(jìn)行10 000倍稀釋時，其殺菌率隨著作用時間的延長而增高，最高值為70.4%，顯示不能有效抑菌。（見表2）

2.2.3 B.suis對綠都牧安（稀戊二醛5%）敏感性試驗(yàn)對照組菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示為30×109CFU/mL；將B. suis菌液進(jìn)行1×107倍稀釋后，與綠都牧安（稀戊二醛5%）分別作用3 min、10 min與30 min，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：將綠都牧安進(jìn)行10倍稀釋時，其抑菌率均為100%，但進(jìn)行100倍、1 000倍及10 000倍稀釋時，其抑菌率隨著稀釋倍數(shù)的增加而顯著降低（p＜0.01），且抑菌率隨著每個濃度消毒液與B.suis作用時間的延長而增高。（見表3）

2.2.4 B.suis對二氯異氰尿酸鈉（45%有效氯）敏感性試驗(yàn)將B.suis菌液進(jìn)行1×107倍稀釋，取0.1 mL菌液分別加入0.9 mL稀釋后的二氯異氰尿酸鈉（45%有效氯）中混勻，作用3 min、10 min與30 min，最后取0.1 mL加入TSA培養(yǎng)基中，涂布均勻，置于37℃培養(yǎng)箱中60～72 h，并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示：B.suis對二氯異氰尿酸鈉敏感性很低，當(dāng)二氯異氰尿酸鈉濃度達(dá)200 mg/mL時，其最高抑菌率為67%，因此該消毒劑不適于布魯氏菌病的消毒。（見表4）

2.3 小結(jié)

通過4種消毒劑對B.suis殺菌率試驗(yàn)的研究，結(jié)果表明，該菌對聚維酮碘溶液敏感性最強(qiáng)，10%聚維酮碘溶液1 000倍稀釋作用3 min便能有效殺滅B.suis；其次戊二醛與癸甲溴銨混合溶液效果顯著優(yōu)于戊二醛單獨(dú)使用，100倍稀釋后可有效殺滅B.suis，1 000倍稀釋后作用30 min可100%殺滅B.suis；而單獨(dú)使用戊二醛，僅在10倍稀釋時3～30 min能有效殺滅該菌，100倍稀釋時作用30 min，其殺菌率僅達(dá)93%；而二氯異氰尿酸鈉在4種消毒劑中消毒效果最不理想，其最高殺菌率僅為67%。

3 討論

表1 B.s uis對綠都金典敏感性試驗(yàn)-菌落計(jì)數(shù)(109CFU/mL)與抑菌率（%）結(jié)果

表2 B.suis對喜衛(wèi)酸敏感性試驗(yàn)-菌落計(jì)數(shù)(109CFU/m L)與抑菌率（%）結(jié)果

表3 B.s uis對綠都牧安敏感性試驗(yàn)-菌落計(jì)數(shù)(109CFU/mL)與抑菌率（%）結(jié)果

表4 B.suis對二氯異氰尿酸鈉敏感性試驗(yàn)-菌落計(jì)數(shù)(109CFU/mL)與抑菌率（%）結(jié)果

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌感染引起的世界范圍內(nèi)的重要的人畜共患傳染病，嚴(yán)重威脅著人和多種動物的生命健康，嚴(yán)重影響了我國畜牧業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展。近幾年我國動物布魯氏病的流行呈現(xiàn)上升趨勢，因此，必須高度重視該病的防治。消毒是貫徹預(yù)防為主方針的一項(xiàng)重要措施，其目的是消滅環(huán)境中的病原體，切斷其傳播途徑，從而抑制疫病繼續(xù)蔓延。隨著養(yǎng)殖規(guī)模及集約化程度的不斷擴(kuò)大，疾病的傳播速度、范圍及感染幾率都在不斷增加，因此有效殺滅環(huán)境中的致病微生物，控制疾病流行，是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)提高產(chǎn)能的有效途徑[5]。噴霧、帶畜禽消毒是養(yǎng)殖場日常工作的必要環(huán)節(jié)，而消毒劑的種類、特性及其合理使用與消毒效果密切相關(guān)[6]。目前市售消毒液按成分不同可以分為醛類、碘類、酚類、季銨鹽類等多種，因此如果選擇有效的消毒劑成為了消毒成敗的關(guān)鍵因素之一[7]。

聚維酮碘屬于碘伏類消毒劑，是由碘與聚乙烯吡咯烷酮絡(luò)合而成的棕褐色液體，殺菌譜廣，性質(zhì)穩(wěn)定，且刺激性小，可通過使菌體蛋白變性或抑制酶活性，而起到滅菌/抑菌的作用[8]。復(fù)方消毒劑一種新型的復(fù)合型消毒劑，其活性成分為戊二醛癸甲溴銨溶液，主要作用為破壞細(xì)菌表面蛋白，試驗(yàn)證明該消毒劑在實(shí)驗(yàn)室的條件下，1∶700倍稀釋，10 min內(nèi)，即可有效殺滅金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌與溶血性鏈球菌，效果顯著優(yōu)于單獨(dú)使用其中一種消毒劑[9]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過4種常用消毒劑對B. suis滅菌率的比較，實(shí)驗(yàn)證明，該菌對聚維酮碘溶液敏感性最強(qiáng)；其次為戊二醛+癸甲溴銨溶液、稀戊二醛溶液；而對二氯異氰尿酸鈉敏感性最低，不能作為布魯氏菌病的日常消毒使用。在消毒過程中，通常消毒效果隨著消毒劑濃度增加及作用時間的延長，其殺菌/抑菌效率越強(qiáng)；在本研究中，也證實(shí)了該理論。但在實(shí)際應(yīng)用中，隨著消毒劑濃度的升高，其對活體組織(畜禽體)的毒性也相應(yīng)增大，且部分消毒劑具有揮發(fā)性或需避光保存等特點(diǎn)。因此，對消毒劑的選擇，應(yīng)根據(jù)畜禽種類、受污染程度、使用方法、成本等因素確定。在殺滅B.suis的研究中，研究顯示聚維酮碘（10%）的有效使用濃度為100～1 000倍稀釋，也可用于皮膚及黏膜的消毒；戊二醛癸甲溴銨溶液有效使用濃度為100～1 000倍稀釋；而單獨(dú)使用戊二醛，進(jìn)行10倍稀釋有效，但出于對成本的考慮，不建議使用；而二氯異氰尿酸鈉對B.suis不敏感，使用效果不佳。雖然本研究僅限于實(shí)驗(yàn)室研究，但該成果也必將為我國畜牧業(yè)的健康發(fā)展提供一些參考與技術(shù)支持?！?/p>

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Study on the Sensitivity of Brucella.suis to Four New Kinds of Disinfectants

Dong Bingmei1,Yang Limei2,Zhang Hanxia3,Lv Sufang2,LiFeng2*
(1.Shandong Lvdu Bio-industry Company,LTD.,BinZhou ShanDong,256600；2.Shandong Binzhou Animal Science &Veterinary Medicine Insitute,BinZhou ShanDong,256600；3.Zouping county animal husbandry and Veterinary Bureau,BinZhou ShanDong,256600)

In order to determine the bacteriostatic effect of new disinfectants on Brucella,we respectively mixed quantitative Brucella.suis(B.suis)with povidone iodine,glutaraldehyde,glutaraldehyde capric methyl bromide compound and dichloroisocyanurate.3min,10min and 30min later,0.1mL mixed liquor was coated on the TSA medium and colony counted.The research shows that the sensibility of povidone iodine was the highest to B.suis,and the povidone iodine solution (10%)can effectively kill B.suis by 1000 times diluted in 3 min.Secondly,the mixed solution of glutaraldehyde and capric methyl bromide was better than glutaraldehyde used alone.It can effectively kill B.suis by 100 times diluted,and 1000 times diluted for 30min.However,the glutaraldehyde can ffectively kill B.suis by 10 times diluted from 3min to 30min.When the glutaraldehyde was diluted 100 times,its sterilization rate decreased to 93%.The disinfection effect of two sodium dichloroisocyanurate is not ideal in the four kinds of disinfectants and its maximum bactericidal rate was only 67%.Therefore,in the four kins of the disinfectants,the povidone iodine and glutaraldehyde capric methyl bromide compound is the best choice to the prevention and control of brucellosis.

Brucella;Disinfectant;Sensitivity;Sterilizing rate

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.1.042

山東省自然資金項(xiàng)目（ZR2013CQ005）,山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣項(xiàng)目（牛羊結(jié)核病和布病監(jiān)測及凈化技術(shù)推廣）

董炳梅（1979-），女，助理研究員，碩士

*通訊作者：李峰，Email：dongbingmei_1998@126.com。