地塞米松誘導(dǎo)少肌性肥胖小鼠模型的建立與評價

魯飛翔，李 軍，周仙杰，劉 飛，朱德生，劉慶春

地塞米松誘導(dǎo)少肌性肥胖小鼠模型的建立與評價

魯飛翔1，李 軍2，周仙杰1，劉 飛3，朱德生2，劉慶春1

目的通過觀察地塞米松誘導(dǎo)C57BL/6小鼠脂肪和肌肉的變化，探究建立理想少肌性肥胖（sarcopenic obesity，SO）小鼠模型的方法。方法 23只6～7月齡雄性C57BL/6小鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組（n=11）和實驗組（n=12）。對照組采用0.9%生理鹽水、實驗組采用10 mg/kg地塞米松磷酸鈉注射液，連續(xù)皮下注射6周，分別于造模第3、6、9、12、15、21、28、35、42天測量兩組的攝食量、體重和體成分；最后一次給藥24 h后，利用水迷宮測量小鼠的游泳速度和輪式跑臺測量小鼠的掉落次數(shù)以評價小鼠的肌肉功能。結(jié)果（1）從造模第1天開始，實驗組平均每日攝食量較對照組明顯增加[（4.49±0.22）g vs（3.55±0.21）g；t=-8.554，P＜0.05]；（2）從造模第21天起，實驗組平均體重較對照組明顯增加[（34.22±2.28）g vs（31.03±2.65）g；t=-3.345, P=0.003]；（3）體成分方面，從造模第28天起，實驗組平均筋肉含量較對照組明顯降低[（21.55±1.21）g vs（23.23±1.40）g；t=3.657，P=0.001]，而從造模第6天起，實驗組平均脂肪含量較對照組明顯增加[（8.80±1.58）g vs（4.96±1.40）g； t=-5.773，P＜0.05]；（4）肌肉功能方面，實驗組平均游泳速度較對照組顯著下降（t=2.825，P=0.010），平均輪式跑臺掉落次數(shù)較對照組顯著增多（t=-2.094，P=0.020）。結(jié)論連續(xù)皮下注射地塞米松誘導(dǎo)成年小鼠能夠建立理想的SO小鼠模型。

地塞米松；少肌性肥胖；肌肉質(zhì)量；肌肉功能

人口老齡化和肥胖是全球面臨的兩大公共健康問題。隨著年齡增長，老年人的身體成分發(fā)生重大變化，一方面表現(xiàn)為肌肉質(zhì)量和功能的逐漸下降，即肌肉衰減綜合征（sarcopenia）；另一方面表現(xiàn)為體脂和內(nèi)臟脂肪的增加。肌肉衰減綜合征最早由Rosenberg于1989年提出，泛指增齡性肌量減少和肌力下降[1]。2010年，歐洲老年人肌肉衰減綜合征工作組（European working group on sareopenia in older people, EWGSOP）提出了目前廣泛使用的肌肉衰減綜合征定義，即老年人骨骼肌質(zhì)量、力量及功能下降的一種病癥[2]。近年來，與年齡有關(guān)的骨骼肌質(zhì)量減少和體脂增加，被定義為少肌性肥胖（sarcopenic obesity，SO）[3]。肌肉衰減綜合征和肥胖并存會協(xié)同增加老年人代謝功能紊亂和心血管疾病風(fēng)險，因而通過評價SO以代替單獨評價脂肪或肌肉的變化能更準(zhǔn)確地評估老年人的不良風(fēng)險結(jié)果。但迄今為止，該病的病因及發(fā)病機理尚未闡明，預(yù)防和干預(yù)措施仍不完善。因此，構(gòu)建SO動物模型對臨床研究具有重要意義。

糖皮質(zhì)激素，又名“腎上腺皮質(zhì)激素”，是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體激素，具有調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)生物合成及代謝的作用。作為糖皮質(zhì)激素的一種，地塞米松具有抗炎、抗過敏和抗休克的功效，但長期注射會導(dǎo)致體重增加、肌肉萎縮、脂肪向心性堆積等副作用[4]。筆者擬利用皮下注射地塞米松誘導(dǎo)成年C57BL/6小鼠SO模型，并利用目前最精確的活體動物體成分測量儀器——Echo MRITM，準(zhǔn)確監(jiān)測肌肉量的變化情況，評價模型的建立效果，通過兩種行為學(xué)實驗設(shè)備對小鼠的肌肉功能進行綜合評價，以期為構(gòu)建理想的SO小鼠模型提供實驗指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6～7月齡雄性C57BL/6小鼠23只，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，體重（31.01 ±3.25）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物合格證號:SCXK（京）2012-0001。小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好、清潔的動物房中，室溫21～25℃，相對濕度45%～55%，12 h晝夜照明節(jié)律，自由攝食和飲水。動物實驗經(jīng)動物福利委員會審批。

1.1.2 藥物及儀器 地塞米松磷酸鈉注射液規(guī)格: 5 mg/ml（國藥集團榮生制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H41020036）；Echo MRITM小動物體成分分析儀購自匯佳生物股份（中國）有限公司；Morris水迷宮和YLS-4C轉(zhuǎn)棒式疲勞儀均購自北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 地塞米松的配置:將5 mg/ml地塞米松磷酸鈉注射液取1 ml與4 ml 0.9%生理鹽水混勻配成濃度為1 mg/ml的新鮮地塞米松。

1.2.2 動物分組與造模 實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，對小鼠進行稱重和排序，按隨機數(shù)字表分成2組，對照組11只，實驗組12只，每只單籠飼養(yǎng)。造模方法:每天分別給予對照組和實驗組小鼠皮下注射0.9%生理鹽水和10 mg/kg地塞米松，皮下給藥體積均為0.1 ml/10 g，連續(xù)6周，1次/d。期間各組給予充足的飼料和水，墊料每周更換一次，保持干燥。

1.2.3 體成分測量 準(zhǔn)確稱量體重后，直接將小鼠放置在一定大小的透明塑料動物艙內(nèi)（儀器配備分40 g、80 g和100 g三個型號，本實驗選用40 g型號的動物艙），將動物艙插入Echo MRITM側(cè)面的管狀空間，通過儀器專用的控制和分析軟件掃描，測量小鼠的筋肉、脂肪、自由水和總水含量。其中測量得到的筋肉含量可直接反映小鼠的整體肌肉量。

1.2.4 肌肉功能測試 （1）水迷宮去平臺，加入適量牛奶，混勻直至水變成乳白色，將小鼠放入水中，水迷宮視頻分析系統(tǒng)記錄小鼠的游泳軌跡，計算90 s內(nèi)游泳平均速度；（2）參照并改進輪式跑臺制造疲勞模型的方法，經(jīng)摸索確定測試小鼠肌肉功能的轉(zhuǎn)速為25 r/min，每次10 min，共3次，每跑10 min休息1 min，計算小鼠在3次測試期間掉落的次數(shù)。

1.2.5 模型評鑒指標(biāo) 造模期間每天觀察小鼠的一般狀態(tài)，主要包括精神狀態(tài)、毛發(fā)顏色、活動情況等；分別于造模第3、6、9、12、15、21、28、35、42天測量兩組的攝食量、體重和體成分，最后一次給藥24 h后測量游泳速度和從輪式跑臺上掉落次數(shù)。實驗組肌肉質(zhì)量（筋肉含量）和功能相比對照組降低為造模成功。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩組不同時間點攝食量、體重、體成分比較采用Bonferroni校正法，對應(yīng)的檢驗水準(zhǔn)調(diào)整為α=0.005。

2 結(jié) 果

2.1 一般狀態(tài) 對照組皮毛順滑且有光澤，精神狀態(tài)良好，較為活潑；而實驗組體型明顯肥胖，毛色光澤度較差，中間夾雜的白毛較多，反應(yīng)遲緩，活動較少（圖1）。

2.2 兩組攝食量的比較 從造模開始，實驗組平均每日攝食量為（4.49±0.22）g，較對照組的（3.55±0.21）g明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-8.554，P＜0.05），不同時間段兩組平均每日攝食量不同，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表2 兩組小鼠造模前及造模后各時間點體重、筋肉含量及脂肪含量的比較

表2 兩組小鼠造模前及造模后各時間點體重、筋肉含量及脂肪含量的比較

注:對照組，皮下注射0.9%生理鹽水；實驗組，皮下注射10 mg/kg地塞米松

觀察指標(biāo) 造模前造模后第3天 第6天 第9天 第12天體重對照組 30.77±2.79 30.66±2.50 30.56±2.45 30.83±2.51 31.17±2.49實驗組 31.27±3.73 32.00±2.86 32.69±2.74 33.08±2.44 33.66±2.35 t值 -0.359 -1.187 -1.964 -2.174 -2.466 P值 0.723 0.246 0.062 0.041 0.022筋肉含量對照組 23.30±1.44 23.37±1.23 23.96±1.35 23.47±1.23 23.21±1.27實驗組 23.73±1.82 22.47±0.86 22.37±0.91 22.37±0.88 22.16±1.01 t值 -0.623 2.015 2.164 2.421 2.198 P值 0.536 0.053 0.039 0.023 0.038脂肪含量對照組 5.30±1.44 4.40±1.35 4.30±1.27 4.79±1.38 4.93±1.37實驗組 5.49±1.91 6.16±1.66 6.94±1.68 7.62±1.68 8.17±1.65 t值 -0.269 -2.775 -4.212 -4.390 -5.097 P值 0.788 0.011 ＜0.005 ＜0.005 ＜0.005觀察指標(biāo) 造模后第15天 第21天 第28天 第35天 第42天體重對照組 31.75±2.83 31.31±2.70 31.01±2.77 31.20±2.76 30.88±2.77實驗組 34.04±2.19 34.62±2.23 34.22±2.35 34.15±2.46 34.27±2.48 t值 -2.159 -3.189 -3.086 -3.148 -3.081 P值 0.040 0.004 0.005 0.004 0.005筋肉含量對照組 23.41±1.78 23.45±1.39 23.20±1.40 23.25±1.22 23.64±1.66實驗組 22.14±0.90 22.05±0.83 21.70±0.84 21.40±1.00 21.52±1.91 t值 2.118 2.912 3.088 3.953 2.835 P值 0.041 0.007 0.005 0.001 0.004脂肪含量對照組 5.34±1.50 5.20±1.55 4.92±1.53 5.33±1.70 4.90±1.69實驗組 8.66±1.56 9.13±1.66 9.04±1.74 9.47±2.09 9.54±1.81 t值 -5.203 -5.850 -6.001 -5.187 -6.329 P值 ＜0.005 ＜0.005 ＜0.005 ＜0.005 ＜0.005

2.3 兩組體重比較 造模前及造模第3、6、9、12、低于對照組，這可能與地塞米松對成年小鼠主要通過促進蛋白質(zhì)降解而誘發(fā)肌肉衰退有關(guān)[12]；實驗組小鼠攝食量在造模初期即出現(xiàn)顯著增加，這可能與地塞米松刺激胃產(chǎn)生胃酸和胃蛋白有關(guān)[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠造模從第6 天起脂肪含量明顯增加，從第21天開始體重明顯增加，提示地塞米松引起小鼠脂肪量增多可能是小鼠體重增加的主要原因。而實驗組小鼠脂肪含量的增加主要是由于地塞米松通過促進肝臟脂肪從頭合成，增加循環(huán)中的脂肪流量，促進脂肪組織中脂肪的沉積[14]。

本研究采用國際最先進的Echo MRITM精準(zhǔn)地檢測小鼠筋肉及脂肪含量的變化，該儀器利用核磁共振成像的原理，能夠測量活體實驗動物的脂肪、筋肉、自由水及總水含量，具有快速、精準(zhǔn)、無需對動物進行麻醉等優(yōu)點[15]。由于目前缺乏能夠明確測量小鼠肌肉功能的儀器，因此本研究采用水迷宮測量小鼠的游泳速度和輪式跑臺測量小鼠的掉落次數(shù)兩種行為學(xué)實驗設(shè)備對小鼠的肌肉功能進行綜合評價，實現(xiàn)了動物模型評價指標(biāo)與臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的高度一致性。

總之，地塞米松不僅能明顯增加小鼠的脂肪含量并降低其肌肉質(zhì)量，還能顯著降低小鼠的肌肉功能，可建立理想且可靠的SO小鼠模型。但本研究未深入探究地塞米松主要通過促進蛋白分解還是抑制蛋白合成而導(dǎo)致肌肉衰退，今后將進一步從分子和蛋白水平檢測地塞米松的促蛋白分解和抑蛋白合成方面的作用。

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（2017-01-10收稿2017-02-09修回）

（本文編輯 付 輝）

Evaluation and establishment of a sarcopenic obesity mouse model induced by dexamethasone

LU Feixiang1, LI Jun2, ZHOU Xianjie1, LIU Fei3, ZHU Desheng2, and LIU Qingchun1.
1. Purchasing Center, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039, China; 2. Laboratory Animal Center, Peking University, Beijing 100871， China；3. Department of Information, Third Hospital of Beijing Municipal Corps， Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100141, China
Corresponding author: LIU Qingchun, E-mail: lqc@vip.163.com

ObjectiveThe study objective was to explore the construction method of an ideal sarcopenic obesity (SO) mouse model by observing the changes of fat and muscle in C57BL/6 mice induced by dexamethasone.MethodsTwenty-three 6-7 months old male C57BL/6 mice were divided into control group (n=11) and experimental group (n=12) by the means of random number table allocation, the control group was treated with 0.9% normal saline while the experimental group was treated with 10 mg/kg dexamethasone sodium phosphate injection, both groups were given subcutaneous injections for consecutive six weeks. The food intake, body weight and body composition of these mice were measured every three days in the first two weeks and every seven days in the following four weeks; to evaluate the function of the mice comprehensively the swimming speed in the water maze and the number of times the mice fell off the rotary treadmill 24 hours after the last dosing were measured.Results(1) From the first day of the model establishment, the average daily food intake of the experimental group increased significantly compared to the control group [(4.49±0.22) g vs (3.55±0.21) g；t=-8.554，P＜0.05]; (2) From the twenty-first day of the model establishment, the average weight of the experimental group increased significantly compared to the control group [(34.22±2.28)g vs (31.03±2.65) g; t=-3.345, P=0.003]; (3) As for the body composition, from the twenty-eighth day of the model establishment, the average muscle content in the experimental group was significantly lower than the control group [(21.55±1.21) g vs (23.23±1.40) g; t=3.657, P=0.001], and from the sixth day of the model establishment, the average fat content in the experimental group was significantly increased compared to the control group [(8.80±1.58) g vs (4.96±1.40) g; t=-5.773, P＜0.05]; (4) As for muscle function, the average swimming speed of experimental group decreased significantly compared to the control group (t=2.825, P=0.010), the average number of times the experimental mice fell off the rotary treadmill significantly increased compared to the control group (t=-2.094, P=0.020).ConclusionsAn ideal SO mouse model can be established through the continuous administration of subcutaneous injections of dexamethasone for adult mice.

dexamethasone; sarcopenic obesity; muscle mass; muscle function

R965.1

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.03.008

武警總醫(yī)院院級課題（WZ2016019）

1. 100039 北京，武警總醫(yī)院采購中心；2. 100871，北京大學(xué)實驗動物中心；3. 100141，武警北京總隊第三醫(yī)院信息科

劉慶春，E-mail: lqc@vip.163.com