FK506對(duì)人肝HL-7702細(xì)胞中Akt表達(dá)的影響

李浩言，張雪梅，安 軍，張韶峰，王宏宇，高 飛，馬永華，徐 春

FK506對(duì)人肝HL-7702細(xì)胞中Akt表達(dá)的影響

李浩言，張雪梅，安 軍，張韶峰，王宏宇，高 飛，馬永華，徐 春

目的觀察他克莫司（FK506）對(duì)人肝HL-7702細(xì)胞系胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵位點(diǎn)Akt表達(dá)的影響，以探究FK506誘導(dǎo)血糖升高的分子機(jī)制。方法 選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝HL-7702細(xì)胞系，分為3個(gè)處理組和1個(gè)對(duì)照組。處理組分別用不同濃度的FK506（0.1、1、5 mg/L）處理24 h，對(duì)照組用等量培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（western blot）檢測(cè)各組Akt蛋白的表達(dá)量及其磷酸化水平，同時(shí)采用蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A, PP2A）活性測(cè)定試劑盒測(cè)定PP2A活性。結(jié)果各組Akt的表達(dá)水平及磷酸化位點(diǎn)p-Akt（Ser473）水平無(wú)明顯變化，另一磷酸化位點(diǎn)p-Akt（Thr308）水平（F=5.657，P=0.022）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；當(dāng)FK506 濃度為5 mg/L時(shí)與對(duì)照組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037），隨著FK506濃度的升高，PP2A活性有一定程度升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.857，P=0.501）。結(jié)論FK506引起HL-7702細(xì)胞中Akt磷酸化水平升高，這一變化可能與PP2A無(wú)關(guān)。

Akt；他克莫司；胰島素抵抗；器官移植后糖尿病

他克莫司（FK506）是一種鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑，用于預(yù)防器官移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)，可有效提高移植物的存活率[1]。然而，與其相關(guān)的副作用如移植后糖尿?。╬ost-transplantation diabetes mellitus，PTDM）嚴(yán)重影響移植物的功能。臨床研究顯示，F(xiàn)K506比環(huán)孢素A更易導(dǎo)致糖尿病[2,3]，其誘導(dǎo)糖尿病發(fā)生的機(jī)制尚不清楚。最近研究發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶對(duì)于葡萄糖促進(jìn)胰島素基因轉(zhuǎn)錄具有關(guān)鍵作用[4]，作為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑，F(xiàn)K506抑制胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，損傷胰島β-細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FK506可致胰島素抵抗[5]，研究FK506對(duì)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)分子的影響將有助于揭示其增加胰島素抵抗的機(jī)制。

Akt又稱蛋白激酶B（protein kinase B，PkB），包括蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)308（Thr308）和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)473（Ser473）兩個(gè)位點(diǎn)，是胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)鍵分子。胰島素可激活PI3K-Akt-mTORC信號(hào)通路，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）的轉(zhuǎn)位，增加骨骼肌及脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取，激活糖原合成相關(guān)酶，抑制肝糖輸出[6]。該信號(hào)通路的損傷可能是胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵[7]。蛋白磷酸酶2A（Proteinphosphatase 2A，PP2A）是真核生物廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶。Akt作為PP2A的主要底物，可被其去磷酸化而失去活性。本研究選擇胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子Akt，觀察不同濃度的FK506對(duì)HL-7702細(xì)胞中Akt表達(dá)量及磷酸化水平的影響，并觀察其對(duì)PP2A酶活性的影響，以探究其導(dǎo)致胰島素抵抗的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人肝細(xì)胞系HL-7702細(xì)胞株，購(gòu)自上海中科院細(xì)胞所，培養(yǎng)條件:10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 儀器及耗材 FBS購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Gibco公司；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)ThermoForma公司；FK506粉購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)自美國(guó)Ameresco公司；兔來(lái)源p-Akt（Thr308）單克隆抗體，兔來(lái)源p-Akt（Ser473）單克隆抗體，兔來(lái)源Akt單克隆抗體，辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記抗鼠/兔IgG均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。鼠來(lái)源actin單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；脫脂奶粉購(gòu)自上海碧迪醫(yī)療器械有限公司；PP2A 酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Aplegen公司；Synergy HT酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司；其他常用試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組及處理 10 mg FK506粉溶于250 μl DMSO中，混勻，制備成40 mg/L母液，分裝后儲(chǔ)存于-20℃。人肝細(xì)胞系HL-7702細(xì)胞株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按5×105/ml的密度均勻接種于60 mm培養(yǎng)皿上，隨機(jī)分為處理組（n=3）和對(duì)照組（n=1）。37℃、5%CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，處理組分別更換FK506終濃度為0.1、1、5 mg/L等量含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基（各處理組DMSO終濃度＜ 0.1%，故忽略不計(jì)），對(duì)照組用等量含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。所有細(xì)胞于37℃、5%CO2濕化培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡法（western blot）分析Akt的表達(dá)量及其磷酸化水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗一遍。每組細(xì)胞加入適量RIPA裂解液（內(nèi)含終濃度為1 mmol/L的苯甲基磺酰氟、氟化鈉、正釩酸鈉），4℃放置15 min。充分裂解后，收集裂解液至離心管中，16 000×g離心20 min。收集上清液，BCA（bicinchonininc acid）法測(cè)定蛋白濃度并分裝。制備8%分離膠和5%濃縮膠（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，SDS-PAGE），等量蛋白與4×上樣緩沖液混合，沸水中加熱5 min至蛋白變性。蛋白上樣，電泳。而后于100 V電壓下將蛋白轉(zhuǎn)至硝化纖維膜上。將膜用含5%脫脂奶粉的封閉液孵育3 h，而后孵育一抗，4℃過(guò)夜。TBST（Tris-HCl緩沖鹽溶液加Tween 20）洗膜3次，每次5 min，室溫下孵育二抗1 h。再次用TBST洗膜3次，每次5 min。用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.3 PP2A活性檢測(cè) 參照PP2A 酶活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)，步驟:各處理組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的自配Ser/Thr Assay Buffer漂洗一次細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解液，4℃，15 min后收集蛋白裂解液，期間每隔5 min用手指輕彈一次。15 min后10 000×g，4℃，離心10 min。取上清，BCA法測(cè)蛋白濃度并稀釋至相同濃度。取400 μg蛋白樣品，加入4 μg Anti-PP2A，C subunit，clone 1D6，40 μl Protein A agarose，4℃旋轉(zhuǎn)孵育2 h。1000×g，4℃離心并收集瓊脂糖珠，自配Ser/Thr Assay Buffer洗兩次，試劑盒自帶Ser/Thr Assay Buffer洗一次。棄上清，加入20 μl 試劑盒自帶Ser/Thr Assay Buffer和60 μl底物肽，30℃震蕩孵育10 min。離心，收集上清，在96孔板中分別加入25 μl。每孔加入100 μl Malachite Green顯色，室溫放置15 min。酶標(biāo)儀于650 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度（optical density，OD）值。根據(jù)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線將吸光度折算成磷濃度以計(jì)算酶活性，并得出相對(duì)酶活性。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示。各組數(shù)據(jù)間的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HL-7702細(xì)胞Akt的表達(dá)量及其磷酸化水平 經(jīng)western blot檢測(cè)對(duì)照組及不同濃度FK506處理細(xì)胞內(nèi)Akt表達(dá)量及其磷酸化水平，結(jié)果Akt表達(dá)量（F=0.449，P=0.725）及磷酸化位點(diǎn)P-Akt（Ser473）水平（F=2.795，P=0.109）無(wú)明顯變化。另一磷酸化位點(diǎn)P-Akt（Thr308）水平（F=5.657，P=0.022）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步兩兩比較顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)K506在濃度為5 mg/L時(shí)P-Akt（Thr308）水平顯著升高，差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037，圖1）。

2.2 HL-7702細(xì)胞的PP2A活性 PP2A活性（用相對(duì)值表示）在對(duì)照組為1，F(xiàn)K506濃度為0.1 mg/L時(shí)為1.1601，F(xiàn)K506濃度為1 mg/L時(shí)為1.1067，F(xiàn)K506濃度為5 mg/L時(shí)為1.1556。由圖2可知，隨著FK506濃度的提高，PP2A酶活性有一定升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.857，P=0.501）。

圖1 不同濃度FK506處理HL-7702細(xì)胞的Akt磷酸化水平變化（pAkt/Akt）

圖2 不同濃度FK506處理HL-7702細(xì)胞的PP2A酶活性變化

3 討 論

器官移植是目前終末期器官功能衰竭患者最有效的治療方法。以FK506為代表的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑是預(yù)防器官移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的主要藥物。然而，應(yīng)用該藥所導(dǎo)致的一系列并發(fā)癥嚴(yán)重影響著器官移植術(shù)后移植物存活率和患者的生活質(zhì)量。PTDM是其中發(fā)病率較高，容易導(dǎo)致心腦血管疾病的一種。PTDM的高危因素包括人種、高齡、超重、糖尿病家族史、病毒感染及應(yīng)用免疫抑制劑等[8]，因此免疫抑制劑的劑量和時(shí)間的個(gè)體化原則是目前預(yù)防高危移植后患者發(fā)生糖尿病的可行方法，并且免疫抑制劑所導(dǎo)致的血糖升高機(jī)制成為目前研究的重點(diǎn)，對(duì)鈣調(diào)磷酸酶抑制劑誘導(dǎo)血糖升高的機(jī)制的研究不僅為預(yù)防PTDM的發(fā)生提供理論基礎(chǔ)，也可為2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的探索開(kāi)辟新路徑。

目前，關(guān)于FK506誘導(dǎo)血糖升高的機(jī)制主要有胰島素分泌不足和胰島素抵抗兩方面。之前的臨床研究發(fā)現(xiàn)PTDM患者同時(shí)存在β細(xì)胞功能減退及胰島素抵抗，且與2型糖尿病患者相比，其β細(xì)胞功能減退更為嚴(yán)重[9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)K506可導(dǎo)致大鼠胰島細(xì)胞損傷及胰島素抵抗，其升糖作用具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性，同時(shí)具有可逆性，停藥后可逆轉(zhuǎn)血糖升高[10]。

本研究用不同濃度FK506作用于人肝HL-7702細(xì)胞24 h，結(jié)果顯示:FK506對(duì)Akt的總表達(dá)量無(wú)影響，但是Akt的Thr308位點(diǎn)磷酸化水平呈濃度依賴性升高，即FK506可誘導(dǎo)人肝HL-7702細(xì)胞Akt的磷酸化，激活A(yù)kt。最近的研究顯示Akt在糖脂代謝中發(fā)揮重要作用:Akt是肝細(xì)胞合成甘油三酯的重要信號(hào)分子，Akt的缺失導(dǎo)致肝細(xì)胞合成甘油三酯障礙，Akt的過(guò)度激活則會(huì)增加甘油三酯的合成，發(fā)生高甘油三酯血癥，促進(jìn)胰島素抵抗，所以肝細(xì)胞中正常胰島素信號(hào)通路的傳遞是保證糖脂代謝正常的前提[11]。2型糖尿病患者長(zhǎng)期處于高胰島素血癥[12]，導(dǎo)致肝細(xì)胞胰島素信號(hào)通路的過(guò)度激活，甘油三酯合成增加；高胰島素血癥同時(shí)導(dǎo)致多臟器細(xì)胞的胰島素信號(hào)通路過(guò)度激活，這也是糖尿病腎病、動(dòng)脈粥樣硬化甚至腫瘤發(fā)生的重要因素[13-15]。FK506引起肝細(xì)胞Akt的激活，可能是器官移植后服用FK506患者發(fā)生糖尿病的一種機(jī)制。

PP2A是真核生物廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/ Thr）蛋白磷酸酶?？赏ㄟ^(guò)對(duì)底物的去磷酸化作用參與多種細(xì)胞調(diào)節(jié)Akt是PP2A的底物之一，Akt磷酸化主要受PP2A的調(diào)節(jié)，抑制PP2A的活性可促進(jìn)Akt的磷酸化。本研究觀察到HL-7702細(xì)胞經(jīng)不同濃度的FK506處理后，PP2A的酶活性無(wú)改變，據(jù)此筆者認(rèn)為，由FK506所誘導(dǎo)的Akt的磷酸化可能與PP2A無(wú)關(guān)，另有其他磷酸酶或激酶參與，但這一結(jié)論需要進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)FK506促進(jìn)胰島素信號(hào)通路關(guān)鍵分子Akt在人肝細(xì)胞中的磷酸化，導(dǎo)致Akt激活。Akt的激活促進(jìn)肝細(xì)胞合成甘油三酯，造成高脂血癥，可能是FK506導(dǎo)致胰島素抵抗,甚至血糖升高的機(jī)制之一。然而，肝細(xì)胞胰島素信號(hào)通路中包含眾多位點(diǎn)，本研究?jī)H針對(duì)Akt做了相關(guān)檢測(cè)，對(duì)于闡述PTDM的發(fā)病機(jī)制具有較大的局限性，今后將進(jìn)一步檢測(cè)其他關(guān)鍵位點(diǎn)，以完善FK506導(dǎo)致PTDM的發(fā)病機(jī)制。

[1]Li C J, Li L. Tacrolimus in preventing transplant rejection in Chinese patients-optimizing use [J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 9（3）: 473-485. DOI: 10.2147/DDDT. S41349.

[2]Liu J Y, Song M, Guo M, et al. Tacrolimus versus cyclosporine as primary immunosuppressant after renal transplantation: a meta-analysis and economics evaluation [J]. Am J Ther, 2016, 23（3）: e1720-e1724. DOI: 10.1097/MJT.0000000000000186.

[3]Song J L, Gao W, Zhong Y, et al. Minimizing tacrolimus decreases the risk of new-onset diabetes mellitus after liver transplantation [J]. World J Gastroenterol, 2016, 22（6）: 2133-2141. DOI: 10.3748/wjg.v22.i6.2133.

[4]Oetjen E, Baun D, Beimesche S, et al. Inhibition of human insulin gene transcription by the immunosuppressive drugs cyclosporin a and tacrolimus in primary, mature islets of transgenic mice [J]. Mol Pharmacol, 2003, 63（6）: 1289-1295. DOI: https://DOI.org/10.1124/mol.63.6.1289.

[5]Larsen J L, Bennett R G, Burkman T, et al. Tacrolimus and sirolimus cause insulin resistance in normal sprague dawley rats [J]. Transplantation, 2006, 82（4）: 466-470. DOI: 10.1097/01.tp.0000229384.22217.15.

[6]Li Z W, Sun F, Zhang Y H, et al. Tacrolimus induces insulin resistance and increases the glucose absorption in the jejunum: a potential mechanismof the diabetogenic effects [J]. PLoS One, 2015, 10（11）: e0143405. DOI: 10.1371/journal.pone.0143405.

[7]Gonzalez E, McGraw T E. The Akt kinases: isoform specificity in metabolism and cancer [J]. Cell Cycle, 2009, 8（16）:2502-2508. DOI: 10.4161/cc.8.16.9335 .

[8]Hers I, Vincent E E, Tavaré J M. Akt signalling in health and disease [J]. Cell Signal, 2011, 23（10）: 1515-1527. DOI: 10.1016/j.cellsig.2011.05.004.

[9]王文君，徐 春，牛玉堅(jiān)，等. 肝移植術(shù)后胰島素敏感性和胰島β細(xì)胞功能的改變[J]. 中國(guó)糖尿病雜志, 2012, 20（2）: 133-135. DOI: 10.3969/j.issn.1006-6187.2012.02.014.

[10]王文君，牛玉堅(jiān)，徐 春，等. 肝移植后糖尿病與2 型糖尿病的胰島素分泌特點(diǎn)比較[J/CD]. 中華臨床醫(yī)師雜志（電子版）, 2012, 6（17）:5259-5261. DOI: 10.3877/ cma.j.issn.1674-0785.2012.17.061.

[11]Xu C, Niu Y J, Liu X J, et al. Tacrolimus reversibly reduces insulin secretion, induces insulin resistance, and causes islet cell damage in rats [J]. Int J Clini Pharmacol Ther, 2014, 52（7） : 620-627. DOI: 10.5414/CP202090.

[12]Haber E P, Procópio J, Carvalho C R, et al. New insights into fatty acid modulation of pancreatic beta-cell function [J]. Int Rev Cytol, 2006, 248: 1-41. DOI: 10.1016/S0074-7696(06)48001-3.

[13]Abeyrathna P, Su Y. The critical role of Akt in cardiovascular function [J]. Vascul Pharmacol, 2015, 74: 38-48. DOI:10.1016/j.vph.2015.05.008.

[14]Yu H, Littlewood T, Bennett M. Akt isoforms in vascular disease [J]. Vascul Pharmacol, 2015, 71: 57-64. DOI: 10.1016/j.vph.2015.03.003.

[15]Lan A, Du J. Potential role of Akt signaling in chronic kidney disease [J]. Nephrol Dial Transplant, 2015, 30（3）: 385-394. DOI: 10.1093/ndt/gfu196.

（2017-01-01收稿2017-01-25修回）

（本文編輯 付 輝）

Effects of tacrolimus on the expression of Akt in human hepatocytes line HL-7702

LI Haoyan, ZHANG Xuemei, AN Jun, ZHANG Shaofeng, WANG Hongyu, GAO Fei, MA Yonghua, and XU Chun.
Department of Endocrinology, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039, China
Corresponding author: XU Chun, E-mail: wjxuchun@sohu.com

ObjectiveThe study aimed to investigate the effects of tacrolimus (FK506) on the expression of Akt, a key site of insulin signalling pathway in human hepatocytes line (HL-7702), thereby exploring the molecular mechanisms of hyperglycemia induced by FK506.MethodsHL-7702 cells in logarithmic growth phase were selected and divided into three treatment groups and one control group. The three treatment groups were respectively treated with different concentrations of FK506 (0.1, 1, 5 mg/L) for 24 hours, the control group was cultured for 24 hours with equal amount of medium. The expression of Akt protein and its phosphorylation level were detected by western blot, and the activity of protein phosphatase 2A (PP2A) was measured by means of PP2A kit.ResultsThe expression of Akt and the level of phosphorylation of Akt (Ser473) had no significant change in each group, the difference of the other phosphotylation of Akt (T308) was statistically significant (F=5.657, P=0.022) among all the groups; The treatment group with the concentration of tacrolimus 5 mg/L was significantly higher as compared to the control group (P=0.037); With the increase of FK506 concentration, the PP2A activity was increased to a certain degree, but the difference was not statistically significant (F=0.857, P=0.501).ConclusionsFK506 can increase the phosphorylation level of Akt in HL-7702, which may not be related to PP2A.

Akt; tacrolimus; insulin resistance; post-transplantation diabetes mellitus

R587.1

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.03.007

武警總醫(yī)院科研項(xiàng)目（WZ20130104）

100039 北京，武警總醫(yī)院內(nèi)分泌科

徐 春，E-mail:wjxuchun@sohu.com