大鼠子宮角瘺管模型的建立

侯金龍， 袁超文， 黃歡宇，王國(guó)卿

(東北大學(xué) 生命科學(xué)與健康學(xué)院，遼寧 沈陽 110819)

研究報(bào)告

大鼠子宮角瘺管模型的建立

侯金龍， 袁超文， 黃歡宇，王國(guó)卿

(東北大學(xué) 生命科學(xué)與健康學(xué)院，遼寧 沈陽 110819)

目的 探討在大鼠子宮角安置瘺管導(dǎo)管的可行性。方法 對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉后，在近子宮體端子宮角放置瘺管導(dǎo)管，并進(jìn)行組織病理學(xué)和妊娠功能的研究。結(jié)果 大鼠子宮內(nèi)膜厚度瘺管模型組內(nèi)瘺管留置側(cè)子宮角(497.68±81.64) μm與對(duì)照組(537.90±77.29)μm和瘺管模型組內(nèi)對(duì)側(cè)子宮角(503.56±76.34)μm相比差異不顯著(P>0.05)；大鼠胚胎植入數(shù)量瘺管模型組(9.67±1.95)個(gè)與對(duì)照組(12.15±2.06) 個(gè)相比顯著減少(P<0.05)；瘺管模型組內(nèi)瘺管側(cè)子宮角(5.83±3.54)個(gè)與對(duì)側(cè)子宮角(6.17±3.67)個(gè)相比差異不顯著(P>0.05)。結(jié)論 子宮角瘺管導(dǎo)管模型對(duì)大鼠子宮組織結(jié)構(gòu)影響較小，能夠滿足向子宮腔內(nèi)長(zhǎng)期注射病原微生物或者化學(xué)藥物等的試驗(yàn)要求。

大鼠;子宮角;瘺管模型

大鼠具有繁殖周期短，成年雌鼠在動(dòng)情周期的不同階段，陰道粘膜可發(fā)生典型變化的特點(diǎn)，是制備子宮疾病模型較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。在子宮病理生理的研究中，有時(shí)需要向大鼠子宮腔內(nèi)反復(fù)注射病原微生物或者化學(xué)藥物等，目前主要通過兩種途徑來實(shí)現(xiàn)：一種是使用陰道開膣器和子宮灌注針經(jīng)陰道和子宮頸進(jìn)行注射[1]，另一種是在背外側(cè)或者腹中線開口暴露子宮角后進(jìn)行注射[2-6]。但這兩種方法都存在嚴(yán)重不足，經(jīng)陰道和子宮頸注射，由于大鼠體型較小，子宮頸收縮較緊時(shí)容易將針頭刺入腹腔，會(huì)對(duì)大鼠造成不同程度的傷害。采用反復(fù)在背外側(cè)或者腹中線開口暴露子宮角后進(jìn)行注射的方式，不宜反復(fù)進(jìn)行操作，也不符合動(dòng)物福利的要求，同時(shí)這種方式也會(huì)使大鼠產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，通過建立大鼠子宮角瘺管模型可彌補(bǔ)上述不足。關(guān)于子宮角瘺管導(dǎo)管模型在羊[7]已有相關(guān)報(bào)道，子宮角瘺管模型可長(zhǎng)期反復(fù)向子宮腔內(nèi)注射病原微生物或者化學(xué)藥物等，進(jìn)行慢性實(shí)驗(yàn)，對(duì)子宮病理生理進(jìn)行長(zhǎng)期深入的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)Wistar大鼠，體重240～260 g，14～15周齡，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)2015-0001]。實(shí)驗(yàn)在沈陽化工研究院進(jìn)行[SYXK(遼)2012-0004]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料：舒泰50(法國(guó)維克有限公司)、快速瑞士-吉姆薩染液(南京建成科技有限公司)、復(fù)方泛影葡胺注射液(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)、滂胺天藍(lán)(上海源葉生物科技有限公司)、一次性使用硬膜外麻醉導(dǎo)管(F3-II型，常州邁創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司)、HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)、常規(guī)手術(shù)器械等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 子宮角瘺管導(dǎo)管的制作：將硬膜外麻醉導(dǎo)管剪成8 cm小段，兩端剪成鈍圓形，防止刺傷組織。將“Y”型導(dǎo)管固定翼用醫(yī)用膠水固定在硬膜外麻醉導(dǎo)管上，距離硬膜外麻醉導(dǎo)管一端0.5 cm，使用前應(yīng)用0.1%的新潔爾滅消毒。

1.2.2 造模方法：陰道涂片法檢查具有正常動(dòng)情周期的24只雌性Wistar大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和瘺管模型組，每組12只。各組分別做如下處理：對(duì)照組大鼠不做任何處理；瘺管模型組大鼠按50 mg/kg的體重腹腔注射舒泰50，麻醉后從腹中線開口，找到一側(cè)子宮角，將子宮角瘺管導(dǎo)管放入子宮腔內(nèi)，導(dǎo)管留置在子宮腔內(nèi)的部分約0.5 cm，用6-0縫合線將導(dǎo)管固定翼縫合在子宮漿肌層上，注意保持子宮角原有的自然狀態(tài)，將子宮角瘺管導(dǎo)管穿出腹壁并將其固定，經(jīng)導(dǎo)管接頭向子宮角內(nèi)注射生理鹽水0.1 mL，無滲漏，縫合腹腔。子宮角瘺管導(dǎo)管近導(dǎo)管接頭端用醫(yī)用膠水密封。瘺管模型組大鼠術(shù)后頸部套自制項(xiàng)圈防止其啃咬傷口及子宮角瘺管導(dǎo)管，待其清醒后放回籠中單獨(dú)飼養(yǎng)。瘺管模型組大鼠每隔12 h剪掉醫(yī)用膠水密封處，經(jīng)導(dǎo)管接頭注射生理鹽水防止導(dǎo)管阻塞。

瘺管模型組大鼠于第3天麻醉后，經(jīng)瘺管導(dǎo)管向子宮內(nèi)注射76%泛影葡胺0.1 mL，在X光下進(jìn)行觀察，檢查子宮角瘺管導(dǎo)管是否暢通和是否保留在子宮腔內(nèi)，檢查完成后繼續(xù)飼養(yǎng)，不再向子宮內(nèi)注射生理鹽水，于術(shù)后第7天拆線，但不拆除自制項(xiàng)圈。于術(shù)后第14 天后選擇間情期的對(duì)照組和瘺管模型組大鼠各6只，處死分離子宮角進(jìn)行HE染色。其余大鼠于發(fā)情期與雄性大鼠按1∶1的比例進(jìn)行合籠，次日清晨陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子者作為妊娠第1 天，于妊娠第8 天進(jìn)行麻醉，尾靜脈注射1%滂胺天藍(lán)染液2.5 mL，3 min后處死大鼠，分離子宮，觀察記錄各組大鼠子宮角的胚胎植入點(diǎn)(藍(lán)斑區(qū))。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠子宮角瘺管導(dǎo)管手術(shù)造模結(jié)果

子宮角瘺管導(dǎo)管制作完畢(圖1)，導(dǎo)管接頭用于連接瘺管導(dǎo)管和注射器，導(dǎo)管固定翼用于將導(dǎo)管固定在大鼠子宮的漿肌層上。大鼠麻醉后經(jīng)腹中線開口進(jìn)行插管(圖2)。瘺管模型組大鼠于第3天麻醉后，經(jīng)瘺管導(dǎo)管向子宮內(nèi)注射76%泛影葡胺0.1 mL，在X光下進(jìn)行觀察，可見泛影葡胺經(jīng)子宮角瘺管導(dǎo)管注入到子宮腔內(nèi)(圖3)，說明子宮角瘺管導(dǎo)管暢通并且保留在子宮腔內(nèi)。

2.2 HE染色組織學(xué)觀察結(jié)果

大鼠子宮從內(nèi)至外可分為內(nèi)膜、肌層和外膜，在發(fā)情周期中，子宮經(jīng)歷一系列明顯的變化。子宮內(nèi)膜由上皮和固有層構(gòu)成。上皮為單層柱狀上皮，固有層的淺層有較多的細(xì)胞成分及子宮腺導(dǎo)管，深層中細(xì)胞成分較少，但布滿了分支管狀的子宮腺及其導(dǎo)管。試驗(yàn)中選擇間情期大鼠進(jìn)行HE染色組織學(xué)觀察(圖4)。并對(duì)子宮內(nèi)膜的厚度進(jìn)行了測(cè)量，其中對(duì)照組大鼠的子宮內(nèi)膜厚度為(537.90±77.29)μm，瘺管模型組內(nèi)瘺管側(cè)子宮角內(nèi)膜厚度為(497.68±81.64)μm，對(duì)側(cè)子宮角內(nèi)膜厚度為(503.56±76.34)μm。各組大鼠的子宮內(nèi)膜厚度差異不顯著(P>0.05)。瘺管留置側(cè)子宮未觀察到炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和上皮細(xì)胞脫落。

2.3 妊娠功能觀察結(jié)果

各組大鼠于妊娠第8天注射1%滂胺天藍(lán)染液，觀察記錄子宮角的胚胎植入情況，以評(píng)價(jià)瘺管對(duì)子宮妊娠功能的影響。對(duì)照組和瘺管模型組大鼠交配后均能受孕(圖5)，其中對(duì)照組胚胎植入數(shù)量為(12.15±2.06)個(gè)和瘺管模型組胚胎植入數(shù)量為(9.67±1.95)個(gè)。胚胎植入數(shù)量瘺管模型組與對(duì)照組相比明顯減少，差異顯著(P<0.05)。瘺管模型組內(nèi)瘺管側(cè)子宮角胚胎植入數(shù)量為(5.83±3.54)個(gè)，對(duì)側(cè)子宮角胚胎植入數(shù)量為(6.17±3.67)個(gè)，瘺管側(cè)子宮角與對(duì)側(cè)子宮角相比胚胎植入數(shù)量差異不顯著(P>0.05)。

圖1 子宮角瘺管導(dǎo)管Fig.1 Uterine horn fistula

圖2 子宮角瘺管模型Fig.2 Uterine horn fistula model

圖3 大鼠瘺管模型X光片F(xiàn)ig.3 X-ray of the rat uterine horn fistula model

注：A對(duì)照組子宮角，B瘺管模型組瘺管留置側(cè)子宮角，C瘺管模型組對(duì)側(cè)子宮角圖4 大鼠子宮HE染色，200×，標(biāo)尺=60μmNote. A: Control group; B: Uterine horn of the fistula side; C: Uterine horn of the opposite side.Fig.4 Histology of the rat uterine tissues. HE staining, ×200,Bar=60 μm

注：A對(duì)照組，B瘺管模型組圖5 圖5 子宮胚胎植入點(diǎn)Note. A: Control group; B: Fistula model group.Fig.5 Embryo implantation site in the uterine horns

3 討論

由于大鼠動(dòng)情周期的存在，因此大鼠瘺管導(dǎo)管的安放存在時(shí)間的選擇問題。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，在大鼠動(dòng)情的不同時(shí)期(動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和動(dòng)情間期)進(jìn)行手術(shù)安放瘺管導(dǎo)管，并進(jìn)行妊娠功能檢查，大鼠均能受孕。動(dòng)情期大鼠子宮相比其他時(shí)期較粗大，容易安放，但是子宮組織較脆，對(duì)子宮的損傷較大。動(dòng)情間期大鼠子宮相比其他時(shí)期韌性較強(qiáng)，安放瘺管導(dǎo)管時(shí)對(duì)組織損傷較小，因此選擇動(dòng)情間期安放瘺管導(dǎo)管相比其他時(shí)期較好。造模大鼠應(yīng)選擇動(dòng)情周期正常，體重較大的個(gè)體，否則手術(shù)操作會(huì)帶來困難。因?yàn)樽訉m乳的存在，可能會(huì)阻塞瘺管導(dǎo)管，因此應(yīng)根據(jù)瘺管導(dǎo)管使用時(shí)間的長(zhǎng)短，定時(shí)向?qū)Ч軆?nèi)注射生理鹽水，防止導(dǎo)管阻塞。

評(píng)價(jià)大鼠子宮角瘺管模型建立成功與否的一個(gè)重要指標(biāo)是該模型是否影響了大鼠子宮胚胎孕育的功能。因此造模成功的關(guān)鍵在于：第一，子宮角瘺管導(dǎo)管模型應(yīng)能夠保持子宮腔暢通，能夠允許精子自由通過并與卵子結(jié)合；第二，子宮角瘺管導(dǎo)管不能引起子宮內(nèi)膜發(fā)生炎癥反應(yīng)和不影響子宮正常的血液循環(huán)；第三，子宮角瘺管導(dǎo)管模型要保持子宮原有的自然形態(tài)和良好的伸展性，滿足胚胎發(fā)育的需要；第四，子宮內(nèi)膜應(yīng)對(duì)雌、孕激素應(yīng)答良好，并在雌、孕激素的作用下與胚泡同步發(fā)育[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，大鼠造模后14 d，利用雄性大鼠進(jìn)行合籠交配，通過觀察子宮的受孕情況及胚胎情況來評(píng)價(jià)大鼠子宮胚胎孕育功能。通過大體解剖觀察子宮角瘺管導(dǎo)管側(cè)子宮存在胚胎，說明子宮角瘺管導(dǎo)管對(duì)子宮腔內(nèi)環(huán)境影響較小，不影響胚胎著床。但是插管部位子宮沒有觀察到胚胎著床，所以應(yīng)選擇插管部位以外的區(qū)域進(jìn)行取材。瘺管模型組大鼠的胚胎數(shù)也少于對(duì)照組，其主要原因是大鼠子宮安置瘺管處至子宮體段區(qū)間的子宮角胚胎數(shù)量較少。瘺管模型組內(nèi)瘺管側(cè)子宮角胚胎植入數(shù)量與對(duì)側(cè)子宮角胚胎植入數(shù)量相比差異不顯著，這主要是由于兩側(cè)子宮角胚胎植入數(shù)量變動(dòng)較大造成的。通過對(duì)處于間情期大鼠進(jìn)行HE染色組織學(xué)觀察，各組大鼠的子宮結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜厚度差異不顯著。說明瘺管導(dǎo)管對(duì)子宮結(jié)構(gòu)影響較小。

本試驗(yàn)中的子宮角瘺管模型特別適用于向子宮腔內(nèi)長(zhǎng)期注射病原微生物或者藥物等，探討單一因素對(duì)子宮病理生理方面的影響。如在制備子宮內(nèi)膜炎疾病模型時(shí)，目前多采用向子宮腔內(nèi)單次注射病原微生物的方法[9-10]。病原微生物作為有生命的個(gè)體，本身或者代謝產(chǎn)物均有可能引起子宮內(nèi)膜炎，并且病原微生物在子宮腔內(nèi)的存活是一個(gè)長(zhǎng)期的過程，因此為了研究引起子宮內(nèi)膜炎的主要致病物，就需要向子宮腔內(nèi)長(zhǎng)期注射病原微生物的代謝產(chǎn)物，從而更好地研究子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病機(jī)理。

試驗(yàn)中篩選出了適宜制備子宮角瘺管的導(dǎo)管，并對(duì)瘺管導(dǎo)管動(dòng)物模型進(jìn)行妊娠功能和組織病理學(xué)方面的觀察，大鼠子宮角瘺管模型對(duì)動(dòng)物機(jī)體損傷較小，能夠適用于向子宮腔內(nèi)長(zhǎng)期注射病原微生物或者藥物等的試驗(yàn)要求。

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Establishment of a rat model of uterine horn fistula

HOU Jin-long, YUAN Chao-wen, HUANG Huan-yu, WANG Guo-qing

(College of Life and Health Sciences, Northeastern University, Shenyang 110819, China)

Objective To explore the feasibility of catheter implantation in a rat model of uterine horn fistula. Methods The catheter was placed into the uterine horns at one side in the rats, then histopathology and pregnancy function were studied. Results The endometrial thickness of the fistula side in the fistula model group (497.68±81.64 μm) was not significantly different compared with the control group (537.90±77.29 μm) and the opposite side (503.56±76.34 μm) (P>0.05). The number of embryo breeding in the fistula model group (9.67±1.95) was significantly decreased compared with the control group (12.15±2.06). The number of embryo breeding of the fistula side (5.83±3.54) was not significantly different compared with the opposite side (6.17±3.67 ) (P>0.05). Conclusions The effect of catheter on uterine tissue and pregnancy function is minimal, and the model of uterine horn fistula applies to the requirement of long term injection of pathogenic microorganisms or drugs.

Rat, Uterine horn, Fistula model

教育部中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(N130420001)。

侯金龍(1986-)，男，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型。

王國(guó)卿，副教授，E-mail： wangguoqing@mail.neu.edu.cn。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0029-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.006

2016-10-30