自發(fā)性糖尿病長爪沙鼠Rxra在6種組織中的表達(dá)水平分析

龔菁菁，王存龍，李銀銀，李小紅，杜小燕，陳振文

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

研究報告

自發(fā)性糖尿病長爪沙鼠Rxra在6種組織中的表達(dá)水平分析

龔菁菁，王存龍，李銀銀，李小紅，杜小燕，陳振文

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069)

目的 分析糖尿病長爪沙鼠Rxra基因在6種組織中的表達(dá)水平，以期探索長爪沙鼠糖尿病發(fā)生的分子機(jī)制。方法 選取糖尿病長爪沙鼠和正常沙鼠各6只，分別采集動物的骨骼肌、肝臟、脂肪、腎臟、心臟和腦組織，用Real-time PCR和Western blotting檢測Rxra基因在各組織中mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 Real-time PCR的結(jié)果表明，Rxra基因的mRNA水平在糖尿病組動物骨骼肌和脂肪中顯著降低，在肝臟中無差異，而在腎臟、心臟和腦組織中則有高表達(dá)趨勢。Western blotting結(jié)果顯示，糖尿病組RXRA的蛋白水平在骨骼肌組織中顯著降低，在脂肪組織幾乎檢測不到，在其他各組織表達(dá)情況有所不同，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論Rxra在糖尿病長爪沙鼠骨骼肌和脂肪組織中低表達(dá)，在其他4種組織中表達(dá)水平無差異，說明Rxra對長爪沙鼠糖尿病的影響主要發(fā)生在骨骼肌和脂肪組織中。

長爪沙鼠；2型糖尿??；Rxra；實(shí)時定量熒光PCR；Western blot；

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)統(tǒng)計，2015年全球糖尿病患者為4.15億，預(yù)計到 2040年糖尿病人數(shù)將達(dá)到6.42億[1]。目前，中國糖尿病患病人群已達(dá)到1.096億，并且發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，其中2型糖尿病(T2DM)患者占90%以上[2]，2型糖尿病是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜遺傳病，以葡萄糖耐量降低、胰島素抵抗為主要特征[3]。本課題組前期利用自行培育的近交系長爪沙鼠糖尿病模型為實(shí)驗材料，通過抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization, SSH)的方法從同窩的高血糖和正常血糖長爪沙鼠骨骼肌中發(fā)現(xiàn)維甲酸類受體α(retinoid X receptor alpha，Rxra)差異表達(dá)。但其在糖尿病動物不同組織中的表達(dá)水平如何還不得而知。為了探明Rxra發(fā)揮效應(yīng)的組織器官，本文研究了Rxra在糖尿病沙鼠和正常沙鼠的骨骼肌、肝臟、腎臟、脂肪、心臟和腦組織中mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，以期尋找自發(fā)性糖尿病長爪沙鼠致病機(jī)制中該基因作用的靶器官，為研究2型糖尿病長爪沙鼠新模型的發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗動物

選取近交系糖尿病模型長爪沙鼠和正常對照組沙鼠各6只，12～15周齡，雌雄各半。所有長爪沙鼠均來自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物部，飼養(yǎng)于控制溫濕度的普通環(huán)境中【SYXK(京)2013-0005】。

1.2 樣品采集

動物過量麻醉安樂死后，解剖采集新鮮組織后立即置于液氮中。樣品包括患糖尿病和正常長爪沙鼠的骨骼肌、肝臟、腹部脂肪、腎臟、心臟、腦組織。

1.3 RNA提取及cDNA的制備

從液氮中取出凍存的長爪沙鼠6種組織約30 mg，分別加入TRIzol試劑(Invitrogen，USA)，剪碎后用均質(zhì)器將組織徹底打碎，于室溫放置1 min，然后加入1/5體積的三氯甲烷，震蕩混勻后，4℃放置15 min，4℃14 000 r/min 離心15 min，將上層水相轉(zhuǎn)移至另一離心管，加入等倍體積異丙醇，振搖混勻后4℃靜置10 min，4℃14000 r /min 離心15 min，棄上清。加入70%乙醇，顛倒離心管洗滌沉淀，4℃12 000 r/min 離心10 min，棄上清液。重復(fù)以上步驟1次。室溫自然干燥，加入適量的RNA-free水溶解得到總RNA。脂肪組織的總RNA提取用脂肪RNA提取試劑盒(Qiagen, USA)。采用Nanodrop 2000c (Thermo Scientific, USA)分析RNA濃度和純度。cDNA的制備按照快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技有限公司,北京)對上述總RNA樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到相應(yīng)的cDNA。

1.4 Real-time PCR

按照SSH得到的基因片段序列設(shè)計引物，利用 Primer Premier 5.0 設(shè)計PCR擴(kuò)增引物多對。除肌肉選取Gapdh基因作為內(nèi)參外，其他組織選取β-actin基因作為內(nèi)參基因并設(shè)計引物。引物序列如表1所示，均由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

采用real-time PCR法在Bio-Rad CFX96 Manager System上對Rxra和內(nèi)參基因的mRNA水平進(jìn)行檢測。所用試劑為實(shí)時定量PCR試劑盒(天根)，反應(yīng)體系為20 μL體系。反應(yīng)條件如下: Q-PCR Master Mix 10 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)程序均為: 95℃預(yù)變性15 min，之后95℃10 s，58℃35 s，共擴(kuò)增40個循環(huán)，每個循環(huán)結(jié)束時檢測熒光; 熔解曲線分析從60℃到95℃，每0.5℃檢測1次。

表1 Rxra和內(nèi)參基因Real-time PCR引物序列

1.5 Western blotting

取液氮凍存的長爪沙鼠骨骼肌、肝臟、腎臟、脂肪、心臟和腦組織，剪碎后用組織蛋白提取試劑盒(康為世紀(jì))提取總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進(jìn)行定量。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)蛋白至NC膜。以TBS(25 mmol/L Tris, 0.15 mol/L NaCl, pH 7.2)含5%脫脂牛奶和0. 05% Tween-20 封閉過夜。將膜與Rxra抗體(1∶1000稀釋，CST,USA)4℃孵育過夜，TBST洗3次，與二抗(辣根過氧化酶聯(lián)的抗兔血清)室溫孵育1 h，TBST洗膜后用化學(xué)發(fā)光法顯色。骨骼肌、肝臟、腎臟、心臟和腦組織做免疫印跡時內(nèi)參基因選用Gapdh作為內(nèi)參基因。最后用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)掃描蛋白質(zhì)印跡條帶灰度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗方法分析。以P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Rxra在糖尿病沙鼠和對照組動物6種組織中mRNA表達(dá)的差異

Rxra是糖尿病長爪沙鼠骨骼肌抑制消減雜交篩選出的一個重要基因，它在6種組織中mRNA的表達(dá)水平各不相同(圖1)。在骨骼肌中，Rxra在糖尿病組mRNA表達(dá)水平顯著低于對照組，與抑制消減雜交結(jié)果一致。在脂肪組織中，Rxra顯著低表達(dá)。在腎臟、心臟和腦組織中，糖尿病組Rxra的表達(dá)量略高于對照組，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異。肝臟組織中兩組間mRNA表達(dá)水平基本相同。

2.2 RXRA在糖尿病沙鼠6種組織中蛋白的表達(dá)水平

RXRA在6種組織中Western blotting的結(jié)果顯示(圖2)，骨骼肌中RXRA在糖尿病動物中蛋白表達(dá)顯著低于對照組，與SSH和real-time PCR的結(jié)果一致。在肝臟、腎臟、腦和心臟組織中RXRA在兩組之間的蛋白表達(dá)沒有顯著性變化，但趨勢有所不同。在肝臟和腎臟組織中，糖尿病組RXRA的蛋白表達(dá)量高于對照組，相反在腦和心臟中，糖尿病組該蛋白的表達(dá)量降低。腎臟和心臟組織中RXRA蛋白總體表達(dá)量低，脂肪組織中沒有檢測到RXRA蛋白。

A-F 分別為Rxra在肌肉、脂肪、肝臟、腎臟、腦和心臟中mRNA在糖尿病和對照組中的表達(dá)情況。 用β-actin為內(nèi)參基因進(jìn)行相對定量。(n=6, *P<0.05, **P<0.01)圖1 Rxra在糖尿病沙鼠6種組織中mRNA的表達(dá)情況A-F: The relative mRNA expression levels of Rxra in 6 tissues (muscle, adipose, liver, kidney, brain and heart) between the control and diabetic gerbils. Results were normalized to the housekeeping gene β-actin. (n=6, *P<0.05, **p<0.01)Fig.1 mRNA expression level of Rxra in 6 tissues in the diabetic and control gerbils

A-E 分別為RXRA在肌肉、肝臟、腎臟、腦和心臟組織的蛋白表達(dá)情況。上半部分為曝光后的條帶圖，其中1-6對照組，7-12為糖尿病組，下方是對條帶圖進(jìn)行灰度掃描后的統(tǒng)計圖。(n=6, *P<0.05)圖2 RXRA在糖尿病沙鼠5種組織中蛋白的表達(dá)情況A-E: The relative protein expression levels of RXRA in the muscle, liver, kidney, brain and heart between control and diabetic gerbils. 1 to 6 are control groups, 7 to 12 are diabetes groups. Below the bands of gray scan, semi-quantitation of data shown corresponding statistics determined using Image J. (n=6, *P<0.05)Fig.2 Protein expression level of RXRA in 5 tissues in the diabetic and control gerbils

A-E 分別為RXRA在肌肉、肝臟、腎臟、腦和心臟組織的蛋白表達(dá)情況。上半部分為曝光后的條帶圖，其中1-6對照組，7-12為糖尿病組，下方是對條帶圖進(jìn)行灰度掃描后的統(tǒng)計圖。(n=6, *P<0.05)圖2 RXRA在糖尿病沙鼠5種組織中蛋白的表達(dá)情況A-E: The relative protein expression levels of RXRA in the muscle, liver, kidney, brain and heart between control and diabetic gerbils. 1 to 6 are control groups, 7 to 12 are diabetes groups. Below the bands of gray scan, semi-quantitation of data shown corresponding statistics determined using Image J. (n=6, *P<0.05)Fig.2 Protein expression level of RXRA in 5 tissues in the diabetic and control gerbils

3 討論與結(jié)論

糖尿病是當(dāng)前威脅全球人類健康最重要的非傳染性疾病之一[4]。2型糖尿病是糖尿病最主要的形式，是多基因參與的復(fù)雜性疾病，其機(jī)制一直是人們研究的熱點(diǎn)，目前對T2DM的病因和關(guān)鍵基因的篩選還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。糖尿病動物模型已成為研究2型糖尿病機(jī)制重要的手段，自發(fā)性動物模型是研究糖尿病遺傳相關(guān)分子機(jī)制的關(guān)鍵載體，與人類相關(guān)疾病有相似之處。目前已經(jīng)有多種自發(fā)性糖尿病模型被開發(fā)使用[5]。本課題組在培育長爪沙鼠(Mongolian gerbil)近交系的過程中，偶然發(fā)現(xiàn)了一個分支動物的血糖較高，經(jīng)過3年的培育逐步形成了長爪沙鼠糖尿病模型群體，其生化指標(biāo)和病理組織形態(tài)均符合2型糖尿病標(biāo)準(zhǔn)，且這些性狀具有遺傳性，成為研究2型糖尿病的病理生理特點(diǎn)以及致病機(jī)制的理想動物模型材料。

由于2型糖尿病會影響一些外周組織和核心器官的代謝和功能，我們選取了骨骼肌、肝臟、脂肪、腎臟、心臟和腦組織進(jìn)行分析。骨骼肌作為最大的葡萄糖吸收和脂肪酸氧化的器官，對全身糖代謝起到非常重要的作用[6]。肝臟是體內(nèi)物質(zhì)代謝的重要器官，參與糖代謝并對機(jī)體血糖的儲存、分布和調(diào)節(jié)具有重要意義。脂肪組織可以儲存和分泌脂肪酸，還具有復(fù)雜的內(nèi)分泌功能，產(chǎn)生多種激素和細(xì)胞因子包括瘦素和脂聯(lián)素，廣泛參與糖代謝、脂代謝、炎癥等病理過程，影響肌肉、肝臟、血管和腦等組織器官的代謝功能[7]。糖尿病患者血漿葡萄糖代謝紊亂是造成機(jī)體某些器官損害的原因之一，在持續(xù)高糖狀態(tài)下，腦內(nèi)線粒體利用葡萄糖產(chǎn)生大量活性氧導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，影響腦部電生理和病理狀態(tài)[8]。而腎臟中糖尿病相關(guān)的血糖紊亂、微血管病變可致慢性腎功能不全、蛋白尿以及腎小球病變[9]。糖尿病時機(jī)體的病生理改變,比如持續(xù)慢性高血糖狀態(tài)、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能失調(diào)和血脂代謝功能異常等，都會導(dǎo)致冠心病和動脈粥樣硬化病變的出現(xiàn)和惡化，直接影響心臟功能[10]。由此可見，糖尿病會造成上述6種器官的代謝和功能紊亂，因此，我們選取這些組織來研究Rxra的表達(dá)。

維甲類X受體α (Rxrα)是一個獨(dú)特的核受體超家族成員，在癌癥、代謝紊亂和神經(jīng)退行性疾病的藥物干預(yù)和治療中是一個有趣和不尋常的靶點(diǎn)。肝臟能廣泛表達(dá)Rxra，一些碳水化合物和氨基酸代謝可受肝臟Rxra調(diào)節(jié)，Rxra調(diào)控相關(guān)通路能很大程度上影響肝臟健康同時調(diào)節(jié)一些疾病過程[11]，肝臟中Rxra及其下游通路是介導(dǎo)維甲酸調(diào)控脂代謝通路的重要因子[12]。Rxra在脂肪細(xì)胞代謝中也發(fā)揮重要作用，一些維甲酸受體結(jié)合物參與調(diào)節(jié)脂代謝。Rxra是膽固醇生成和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，當(dāng)敲除小鼠肝臟中的Rxra時，血清中的膽固醇和甘油三酯水平會升高。Rxra的變異還能通過影響腦組織的膽固醇代謝成為阿爾茲海默癥的一個風(fēng)險因子[13]。同時，Rxr可通過自身形成同源二聚體或與其他核受體形成異二聚體，參與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，比如Rxra可與過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARG)形成異質(zhì)二聚體調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[14]。

Rxra在代謝疾病中的這些作用提示它可能與糖尿病發(fā)生的分子機(jī)制有關(guān)。本實(shí)驗中，我們檢測了Rxra在糖尿病長爪沙鼠6種組織中的表達(dá)水平，Rxra的Q-PCR和Western blotting結(jié)果均顯示，在骨骼肌組織中，該基因在糖尿病組的mRNA表達(dá)量和蛋白水平均顯著低于對照組。Rxra是在糖尿病動物骨骼肌組織中經(jīng)SSH篩選出來的基因，本研究的結(jié)果與SSH結(jié)果一致，證明了SSH結(jié)果的可靠性，也首次闡釋了Rxra基因在糖尿病動物肌肉組織中的低表達(dá)特征。在脂肪組織中，該基因mRNA水平在糖尿病組中顯著降低，但用Western blotting 方法幾乎檢測不到RXRA蛋白，這說明可能有一些調(diào)控機(jī)制除了抑制其在糖尿病動物脂肪組織的轉(zhuǎn)錄，更一步抑制了它的翻譯；也可能是免疫印跡的方法不夠靈敏。在肝臟組織中，無論mRNA還是蛋白，雖然表達(dá)水平都很高，但兩組表達(dá)均無差異，進(jìn)一步說明Rxra基因在肝臟中的高表達(dá)[15]。在腎臟、心臟和腦組織中糖尿病組mRNA表達(dá)量均部分低于對照組，蛋白水平檢測也發(fā)現(xiàn)在這些組織中表達(dá)情況各異，但都沒有顯著性差異。這些結(jié)果說明，RXRA基因與長爪沙鼠糖尿病的發(fā)生相關(guān)，且其靶器官可能是肌肉。

總之，在長爪沙鼠糖尿病模型中，我們發(fā)現(xiàn)Rxra可能與糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，特別是在肌肉和脂肪組織中。這為研究糖尿病及糖代謝調(diào)控的具體分子機(jī)制以及模型動物的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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Analysis ofRxraexpression in 6 tissues from spontaneous diabetic Mongolian gerbils

GONG Jing-jing, WANG Cun-long, LI Yin-yin, LI Xiao-hong, DU Xiao-yan, CHEN Zhen-wen

(School of Basic Medical Sciences, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100069, China)

Objective To analyze theRxraexpression level in 6 tissues of diabetic gerbils and explore the molecular mechanism of diabetes in Mongolian gerbils. Methods We collected 6 tissues including skeletal muscle, liver, adipose tissue, kidney, heart and brain from 6 diabetic gerbils and 6 control animals, respectively.RxramRNA and protein expression level in the 6 tissues were separately detected using real-time PCR and western blotting. Results The real-time PCR showed that compared with control animal, mRNA expression ofRxrain skeletal muscle and adipose tissue was significantly decreased in the diabetic group. However, there were no significant differences in the liver between the two groups. The relative expression level in diabetic group exhibited uptrend compared with the control in kidney, heart and brain. According to the results of western blotting, RXRA protein in skeletal muscle was significantly decreased in the diabetes group. RXRA protein was almost undetectable in adipose tissue. Varying expression was observed in other tissues, but there was no significant difference. Conclusions Lower expression ofRxrais observed in the skeletal muscle and adipose tissue of diabetic gerbils. There is no significant difference in other four tissues between the two groups. The results illustrate that the effect ofRxramainly occurres in skeletal muscle and adipose tissue in this diabetic model.

Mongolian gerbils; Type 2 diabetes;Rxra; Real-time PCR; Western blotting

國家科技支撐計劃(編號：2015BAI09B01)；國家自然科學(xué)基金 (編號：31272393和31572348)；北京市自然科學(xué)基金(編號：7141002)。

龔菁菁(1991 -)，女，碩士研究生，專業(yè)：遺傳學(xué)。Email：gongjjing@126.com。

陳振文(1959 -)，男，博士，教授。主要從事實(shí)驗動物教學(xué)和研究。Email：czwenteam@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0059-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.011

2016-08-30