不同劑量酵母和腺嘌呤誘導(dǎo)大鼠痛風(fēng)性腎病模型的建立比較

藍(lán)倫禮，江 濱，劉夢(mèng)楚，鄒曉紅，曹 騁，曾元兒，龐嘉穎

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥分析實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006)

研究報(bào)告

不同劑量酵母和腺嘌呤誘導(dǎo)大鼠痛風(fēng)性腎病模型的建立比較

藍(lán)倫禮，江 濱，劉夢(mèng)楚，鄒曉紅，曹 騁，曾元兒，龐嘉穎

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥分析實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006)

目的 探討不同劑量酵母、腺嘌呤和不同造模持續(xù)時(shí)間對(duì)大鼠痛風(fēng)性腎病模型的影響。方法 模型組雄性SD大鼠用15 g/kg酵母粉和50 mg/kg、100 mg/kg腺嘌呤分別灌胃，同時(shí)分別設(shè)置8、10、22、48的造模天數(shù)。比較各組腎臟肥大指數(shù)的大小，檢測(cè)大鼠腎功能，尿液指標(biāo)的變化，腎皮質(zhì)β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)含量，肝臟黃嘌呤氧化酶(XOD)活性的變化，同時(shí)觀察大鼠腎臟病理改變。并用免疫組化技術(shù)檢測(cè)腎臟組織NGAL、OAT1和TIMP-1的表達(dá)。結(jié)果 隨著模型組造模劑濃度的增加和造模時(shí)間的延長(zhǎng)，腎臟病理改變?cè)矫黠@。100 mg/kg腺嘌呤和15g/kg酵母共同造模8 d，與正常對(duì)照組比較，該組腎臟病理組織變化明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)腎小管上皮細(xì)胞腫脹，腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)未被破壞；腎臟肥大指數(shù)較正常對(duì)照組增大(P<0.01)；與正常對(duì)照組比較，模型A組，B組、E組、F組腎功能下降(P<0.01)，模型A組、B組、E組、F組大鼠的24 h尿量，尿蛋白含量增多(P<0.01)。模型E組大鼠腎組織NGAL、TIMP-1的表達(dá)高于正常組大鼠(P<0.01)，OAT1的表達(dá)低于正常組大鼠(P<0.01)。結(jié)論 100 mg/kg腺嘌呤和15 g/kg酵母共同造模8 d為較理想的造模劑量和造模持續(xù)時(shí)間，痛風(fēng)性腎病模型大鼠腎損傷受蛋白NGAL、TIMP-1和OAT1的影響。

痛風(fēng)性腎??；酵母；腺嘌呤；腎功能

痛風(fēng)性腎病,又稱尿酸性腎病(uric acid nephropathy，UAN)，是由于體內(nèi)嘌呤代謝出現(xiàn)紊亂，使血中尿酸生成過多或腎臟排泄減少，導(dǎo)致血中尿酸呈過飽和狀態(tài)，從而使尿酸結(jié)晶沉積于腎髓質(zhì)、間質(zhì)或遠(yuǎn)端集合管引起的腎損害[1]。UAN主要以腰酸痛、多尿、夜尿、尿血、尿結(jié)石、腎絞痛、水腫、高血壓等臨床癥狀為主。痛風(fēng)性腎病屬西方的一種常見病，發(fā)病率約為0.3%。隨著人們生活方式的改變和飲食結(jié)構(gòu)中高嘌呤食物的大量攝入，此病的發(fā)病率在逐年上升。隨著病情的演進(jìn)惡化，痛風(fēng)性腎病最終導(dǎo)致腎衰竭的形成，歐洲透析移植協(xié)會(huì)報(bào)道終末期腎衰由痛風(fēng)所致者占0.6～1.0%[2]。目前，中西醫(yī)對(duì)痛風(fēng)性腎病的研究還處于初級(jí)階段，而建立與臨床發(fā)病機(jī)制類似的動(dòng)物模型是痛風(fēng)性腎病藥物的篩選和開發(fā)的關(guān)鍵，因此 ,在以往研究的基礎(chǔ)上,參考現(xiàn)有的酵母法[3,4]、腺嘌呤法[5]及酵母聯(lián)合腺嘌呤法[6]。從大鼠的一般狀況、腎臟肥大系數(shù)，尿蛋白定量、腎功能指標(biāo)、腎皮質(zhì)N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG)含量，肝臟黃嘌呤氧化酶 (xanthine oxidase, XO)活性，腎臟病理變化等方面，探討痛風(fēng)性腎病模型的改進(jìn)方法。本實(shí)驗(yàn)通過多次灌胃酵母和腺嘌呤誘導(dǎo)大鼠痛風(fēng)性腎病模型，皆在探討不同劑量酵母、腺嘌呤和不同造模持續(xù)時(shí)間對(duì)大鼠痛風(fēng)性腎病模型的影響，以尋找符合人類痛風(fēng)性腎病發(fā)病機(jī)制理想的動(dòng)物，以供痛風(fēng)性腎病藥物的篩選及藥物作用機(jī)制研究。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SD大鼠57 只，2月齡，雄性。體重220～250 g，SPF級(jí)，來源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK(粵)2013-0020 NO.44005900002210】 飼養(yǎng)環(huán)境: SPF 級(jí)，每籠6 只，溫度( 23 ± 2)℃，濕度(55±5)%，12 /12 h 光照黑暗循環(huán)(光照時(shí)間7:00～19:00)飼養(yǎng)地點(diǎn)：廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)為【SYXK(粵)2013-0085】。

1.2 試劑

酵母提取粉(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)，批號(hào)3204100，規(guī)格400 g/瓶；腺嘌呤(Sigma公司)，批號(hào)101498252，規(guī)格100 g/瓶。β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)試劑盒，尿蛋白定量試劑盒，尿酸(UA)測(cè)試盒，尿素氮(BUN)測(cè)試盒，肌酐 (Cr) 測(cè)定試劑盒(肌氨酸氧化酶法)，均購(gòu)于南京建成生物公司。一抗：兔抗鼠OAT1(陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1抗體，Organic Anion Transporter)(批號(hào)：BA3402，博士德生物技術(shù)有限公司)；一抗：兔抗鼠NAGL(脂質(zhì)運(yùn)載蛋白抗體，neutrophil gelatinase-associated lipocalin)(批號(hào)：BA3435，博士德生物技術(shù)有限公司)；一抗：兔抗鼠TIMP-1(基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1，tissue inhibitor of metalloproteinase-1)(批號(hào)：BA3727，博士德生物技術(shù)有限公司)；二抗：兔IgG免疫組化試劑盒(批號(hào)：SA1022，博士德生物技術(shù)有限公司)；3，3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)(批號(hào)：AR1022，博士德生物技術(shù)有限公司提供)。

1.3 儀器

電子天平JJ300(雙杰測(cè)試儀器廠)；分析天平AEG220(島津制作所)；KQ-300DE型超聲波清洗儀器(昆山市超聲儀器有限公司)；BK-DM500型數(shù)碼生物顯微鏡(重慶奧特)；Leica RM2015型切片機(jī)(德國(guó)徠卡公司)。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及造模方案

2 方法

2.1 試劑的配制

以蒸餾水為溶劑酵母粉配成1.5 g/mL的酵母混懸液；腺嘌呤配制成50 mg/mL和100 mg/mL的混懸液。

2.2 建模與實(shí)驗(yàn)分組

將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為正常對(duì)照組9 只和模型組48 只，正常對(duì)照組給予等體積的蒸餾水灌服，模型組隨機(jī)分配為6 組，分別為A、B、C、D、E、F組，造模期間，兩組動(dòng)物自由飲水，喂飼相同質(zhì)量的飼料，每天觀察大鼠的狀態(tài)(表1)。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

各組大鼠分別于造模結(jié)束前一日，收集24 h尿液，測(cè)定24 h尿量及尿蛋白含量。各組大鼠分別于造模結(jié)束前一日，禁食不禁水24 h，稱量大鼠體重(BW)，以20%烏拉坦溶液腹腔注射,麻醉大鼠，解剖后腹主動(dòng)脈取血，靜置離心后取血清并于全自動(dòng)生化儀上測(cè)定尿酸值、尿素氮和肌酐。分離雙腎，記錄雙腎總重(KW)，

按公式腎臟肥大指數(shù)(KHI)：KHI=(KW/BW)×103

計(jì)算腎臟肥大指數(shù)。甲醛固定24 h后制備病理切片。全腎組織以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，行5 μm連續(xù)切片，HE染色，光鏡下觀察腎小管、腎小球以及腎臟病理改變和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。取腎皮質(zhì)勻漿后，按照試劑盒說明書測(cè)定各組大鼠腎皮質(zhì)N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase, NAG)含量；取1 g肝臟制備成肝勻漿，用HPLC法檢測(cè)肝臟黃嘌呤含量，評(píng)價(jià)大鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性。

2.4 免疫組織化學(xué)染色觀察大鼠腎組織蛋白NGAL、TIMP-1、OAT1的表達(dá)

選定最適宜模型組大鼠的腎臟組織運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)大鼠腎組織蛋白NGAL、TIMP-1、OAT1的表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況比較

實(shí)驗(yàn)過程中每日觀察各組大鼠，與正常對(duì)照組相比，模型A組大鼠隨著造模時(shí)間的增加，尤其在造模第36天后(即加入腺嘌呤聯(lián)合造模時(shí))其活動(dòng)嚴(yán)重減少，弓背蜷縮、體毛疏松、多尿、泄瀉，至造模結(jié)束，上述癥狀愈發(fā)明顯；在造模第8天(酵母和腺嘌呤聯(lián)合造模的第3天，B組大鼠飲食量開始減少，多尿，且所在鼠籠的墊料較潮濕；C組大鼠的飲食，飲水，體毛及精神狀態(tài)無明顯異?，F(xiàn)象；D組大鼠的飲食，飲水，體毛及精神狀態(tài)無明顯異常現(xiàn)象；在酵母和腺嘌呤聯(lián)合造模的第3天后，E組大鼠采食減少，E組大鼠所在鼠籠的墊料較濕；在酵母和腺嘌呤聯(lián)合造模的第3天后，F(xiàn)組大鼠，飲食減少，多尿，所在鼠籠的墊料較濕。

3.2 各組大鼠腎臟肥大指數(shù)比較

與正常對(duì)照組比較**P<0.01, *P<0.05圖1 各組大鼠腎臟肥大指數(shù)比較Note: Compared with the normal control group, *P<0.05, **P<0.01.Fig.1 Comparison of kidney hypertrophy indexes in all groups

由圖1可知，與正常對(duì)照組大鼠相比，模型A組、B組、E組、F組大鼠的腎臟肥大系數(shù)明顯增大 (P<0.01)，模型A組增加最明顯，模型B組次之，隨著造模劑量和造模天數(shù)的增加，腎臟肥大系數(shù)逐漸增大；模型C組和模型D組大鼠的腎臟肥大系數(shù)增大不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tab.2 Comparison of kidney hypertrophy

組別Groups例數(shù)Cases腎臟肥大指數(shù)均值MeanvalueofKHIP值Pvalue正常對(duì)照組Normalcontrolgroup967924±07457模型A組ModelgroupA6158595±19772??0000模型B組ModelgroupB12117187±17937??0000模型C組ModelgroupC674518±070860448模型D組ModelgroupD681745±173290115模型E組ModelgroupE1288571±21587??0006模型F組ModelgroupF697396±11655??0001

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05,**P<0.01

Note: Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01.

由表2所示，與正常對(duì)照組大鼠相比，模型A組、B組、E組、F組大鼠的腎臟肥大系數(shù)明顯增大 (P<0.01)，模型C組和模型D組大鼠的腎臟肥大系數(shù)增大不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.3 各組大鼠腎功能比較

由表3可知,與正常對(duì)照組比較，模型A組，B組、E組、F組大鼠的血清尿酸水平上升明顯(P<0.01)，模型C組和模型D組大鼠的血清尿酸水平上升不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型A組，B組、E組、F組大鼠的血清尿素氮值上升明顯(P<0.01)，模型C組和模型D組大鼠的血清尿素氮上升不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型A組，B組、E組、F組大鼠的血清肌酐值上升均明顯(P<0.01)，模型C組和模型D組大鼠的血清肌酐值上升不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

由表4可知，與正常對(duì)照組比較，模型A組，B組、D組、E組、F組大鼠的24 h尿量增多(P<0.01)，模型C組大鼠的24 h尿量增多 (P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型A組、B組、E組、F組大鼠的尿PH值降低(P<0.01)，模型C組和模型D組大鼠的尿pH值降低不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型A組、B組、E組、F組大鼠的24 h尿蛋白含量增多(P<0.01)，模型C組和模型D組大鼠的24 h尿蛋白含量增多不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠腎功能比較

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05,**P<0.01。

Note:Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01.

表4 各組大鼠尿液指標(biāo)比較

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05,**P<0.01。

Note: Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01.

Tab.5 Comparison of the liver xanthine oxidase

分組Groups例數(shù)(Case)黃嘌呤含量(μg/g)Xanthinecontent(μg/g)正常對(duì)照組Normalcontrolgroup918402±4822模型A組ModelgroupA632454±5196??模型B組ModelgroupB1227715±4645??模型C組ModelgroupC621373±3959模型D組ModelgroupD624259±2067?模型E組ModelgroupE1226832±5226??模型F組ModelgroupF627117±2130??

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05,**P<0.01。

Note: Compared with the normal group,*P<0.05,**P<0.01.

表6 各組大鼠腎皮質(zhì)β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶

Tab.6 Comparison of the NAG content in

組別Groups例數(shù)CasesN?乙酰?β?D?葡萄糖苷(U/gprot))NAG(U/gprot))正常對(duì)照組Normalcontrolgroup915920±2859模型A組ModelgroupA623641±3499??模型B組ModelgroupB1221331±2910??模型C組ModelgroupC616880±3586模型D組ModelgroupD620350±2564?模型E組ModelgroupE1220930±5664??模型F組ModelgroupF621733±2972??

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05,**P<0.01。

Note: Compared with the normal control group,*P<0.05,**P<0.01.

3.4 各組大鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性比較

由表5可知，與正常對(duì)照組大鼠相比，模型A組、B組、E組、F組大鼠的肝臟黃嘌呤含量顯著增加(P<0.01)，模型D組大鼠的肝臟黃嘌呤含量增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.5 各組大鼠腎皮質(zhì)NAG含量比較

由表6可知，與正常對(duì)照組大鼠相比，模型A組、B組、E組、F組大鼠的腎皮質(zhì)NAG含量升高明顯(P<0.01)，模型D組大鼠腎皮質(zhì)NAG含量升高(P<0.05)模型C組大鼠腎皮質(zhì)NAG含量有升高趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.7 腎臟病理學(xué)檢查

3.7.1 肉眼觀察：正常對(duì)照組的大鼠腎臟表面呈淺褐色，無其他明顯病變，皮髓質(zhì)交界清楚。模型A組大鼠的腎臟顏色為褐色，腎臟體積明顯變大，含有密布乳白色的顆粒，形成白色的斑紋，髓質(zhì)和錐體有大量白色向外輻射狀射線，切面皮髓質(zhì)有充血和水腫，皮髓質(zhì)交界清楚。模型B組大鼠腎臟為褐色，白色顆粒較多，髓質(zhì)和錐體存在向外輻射狀的白色射線，程度較重，髓皮質(zhì)交界清楚。模型C、D組大鼠腎臟較深，其外觀與正常對(duì)照組對(duì)照幾乎無異，皮髓質(zhì)交界清楚。模型E、F組大鼠腎臟的外觀相近，為深褐色，有少量乳白色顆粒，髓質(zhì)和錐體有少量向外輻射的白色射線，髓皮質(zhì)交界清楚。

3.7.2 顯微觀察：

3.7.2.1 腎臟 HE染色：切取腎臟，蘇木素-伊紅(HE)染色作病理切片，分別置于100倍(圖2)和400倍(圖3)進(jìn)行腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察，觀察各組大鼠腎臟損傷程度。鏡下觀察結(jié)果顯示：正常對(duì)照組大鼠腎皮質(zhì)中可清晰看見腎小球、腎小管、腎小囊和致密斑等結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)未見明顯病理改變。

模型 A組大鼠腎臟腎皮質(zhì)中的腎小球結(jié)構(gòu)毀壞，腎小管上皮細(xì)胞腫脹明顯，且有大量上皮細(xì)胞發(fā)生壞死，細(xì)胞核與細(xì)胞脫離，部分腎小管呈囊性擴(kuò)張，腎小管管腔中和周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)可見纖維組織增生?？梢娂t棕色的尿酸鹽結(jié)晶。

模型 B組大鼠腎臟的皮質(zhì)中腎小管發(fā)生明顯的壞死，部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹明顯，管中可見壞死的上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞形成的膿團(tuán)，壞死的面積較模型A組少，間質(zhì)中可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見尿酸鹽結(jié)晶。

模型 C組大鼠腎臟腎皮質(zhì)中可見腎小球及周圍腎小管，腎間質(zhì)中血管以及腎小球部分充血，其它病理改變不明顯。

模型 D組大鼠腎臟局部區(qū)域可見腎小管成囊狀擴(kuò)張和上皮細(xì)胞扁平化，間質(zhì)中可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)中血管以及腎小球內(nèi)的充血更為嚴(yán)重。

模型 E組大鼠腎臟腎小管上皮細(xì)胞腫脹，可見腔中有壞死的上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞，管腔擴(kuò)張明顯，同時(shí)伴有上皮細(xì)胞扁平化，腎小球萎縮或充血。

模型F組大鼠腎臟腎小管上皮細(xì)胞腫脹，部分壞死明顯，可見腔中炎性細(xì)胞和壞死的上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞與其細(xì)胞核分離，管腔擴(kuò)張明顯，同時(shí)伴有上皮細(xì)胞扁平化，間質(zhì)中可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3.7.2.2 大鼠腎臟組織免疫組化結(jié)果比較：由圖4、圖5得知，在正常對(duì)照組組中，腎臟組織切片僅見極少部分的腎小管上皮細(xì)胞胞漿中表達(dá)蛋白NGAL，模型E組腎小管上皮細(xì)胞胞漿NGAL的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)。

由圖6、圖7得知，在正常對(duì)照組組中，腎臟組織切片腎小管上皮細(xì)胞胞漿表達(dá)蛋白OAT1，模型E組腎小管上皮細(xì)胞胞漿中蛋白OAT1的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)。

由圖8、圖9得知，在正常對(duì)照組組中，腎臟組織切片僅見極少部分的腎小管上皮細(xì)胞胞漿表達(dá)蛋白TIMP-1，模型E組腎小管上皮細(xì)胞胞漿TIMP-1的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)。

由表7可知，在正常組大鼠中，腎臟組織切片僅見極少部分的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)NGAL、TIMP-1，模型E組腎臟組織的蛋白NGAL、TIMP-1 A值大于正常組(P<0.01)；模型E組腎臟組織的蛋白OAT1的A值明顯低于正常組(P<0.01)。

4 結(jié)論

模型A組、B組、F組大鼠腎功能及尿液指標(biāo)與正常對(duì)照組大鼠比較，差異均有顯著性意義(P<0.01)。模型A組和B組，造模時(shí)間最長(zhǎng)，腎小球、腎小管損傷嚴(yán)重，腎臟結(jié)構(gòu)不同程度損壞，已造成不可逆腎臟衰竭模型，模型F組大鼠腎臟有較大面積的腎小管上皮細(xì)胞壞死，模型過重。模型C組和D組，與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，模型過輕，均不利于防治痛風(fēng)性腎病藥物的篩選和評(píng)價(jià)。模型E組在腎功能，腎臟肥大指數(shù)都與正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在腎臟病理變化上主要為腎小管受累，腎小球未受損傷，總體腎臟病變適中，符合藥物篩選的疾病模型，因此模型E組為較理想的大鼠痛風(fēng)性腎病模型。免疫組化結(jié)果表明，模型組大鼠腎組織NGAL、TIMP-1表達(dá)明顯高于正常組，模型組大鼠腎組織OAT1的表達(dá)則明顯低于正常組大鼠。

表7 兩組大鼠腎臟免疫組化檢測(cè)結(jié)果比較± s)

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05,**P<0.01。

Note: Compared with the normal control group,*P<0.05,**P<0.01.

A.正常組(Normal control group) B. 模型A組(Model group A) C. 模型B組(Model group B) D. 模型C組(Model group C) E. 模型D組(Model group D) F.模型E組(Model groupE) G. 模型F組(Model Fgroup)圖2 各組大鼠腎臟病理組織改變(HE染色，標(biāo)尺=20 μm)Fig.2 The renal pathological changes in the rat groups. (HE staining, Bar=20 μm)

腎小球(Glomerulus, G)，腎小囊(Bowman capsule, BC)，致密斑(Macula densa, MD)，腎小管(Rental tubule, RT)A.正常組(Normal control group) B. 模型A組(Model group A)C. 模型B組(Model group B) D. 模型C組(Model group C) E. 模型D組(Model group D)F.模型E組(Model group E) G. 模型F組(Model group F)
圖3 各組大鼠腎臟病理組織改變(HE染色，標(biāo)尺=20 μm)
Fig.3 The renal pathological changes in the rat groups (HE staining,Bar=20 μm)

正常對(duì)照組(Normal control group) 模型E組(Model E group)圖4 兩組大鼠腎臟組織NGAL的表達(dá)，(免疫組化標(biāo)尺=20 μm)Fig.4 Expression of NGAL in the kidney tissue of the two rat groups, ( Immunohistochemical staining, Bar=20 μm)

圖5 兩組大鼠腎臟NGAL陽(yáng)性表達(dá)的A值比較Fig.5 Comparison of kidney NGAL positive expression in the two rat groups

圖7 兩組大鼠腎臟OAT1陽(yáng)性表達(dá)的A值比較Fig.7 Comparison of the kidney OAT1 positive expression in the two rat groups

正常對(duì)照組 (Normal control group) 模型E組(Model E group)圖6 兩組大鼠腎臟組織OAT1的表達(dá)，(免疫組化，標(biāo)尺=20 μm)Fig.6 Expression of kidney tissue OAT1 in the two rat groups. (Immunohistochemical staining, Bar=20 μm)

正常對(duì)照組 模型E組(Model group E)圖8 兩組大鼠腎臟組織TIMP-1的表達(dá)，免疫組化(標(biāo)尺=20 μm)Fig.8 Expression of TIMP-1 in the kidney tissues two rat groups. Immunohistochemical staining. Bar=20 μm.

圖9 兩組大鼠腎臟TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)的A值比較Fig.9 Comparison of TIMP-1 positive expression in Ridoey tissues of the two rat groups

5 討論

痛風(fēng)性腎病指因血清尿酸升高而導(dǎo)致的腎損害，復(fù)制大鼠痛風(fēng)性腎病模型的意義在于篩選防治痛風(fēng)性腎病的藥物和研究藥物作用的相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中采用灌服酵母和腺嘌呤的方法，觀察大鼠腎臟肥大指數(shù)、腎組織病理學(xué)改變、腎功能變化，旨在探尋該模型中大鼠腎臟損傷的適宜程度，為實(shí)驗(yàn)研究選擇痛風(fēng)性腎病損傷的動(dòng)物模型提供依據(jù)。

痛風(fēng)性腎病的發(fā)生與長(zhǎng)期喜食肥甘厚醇之品及體肥和濕氣重相關(guān)，是僅次于痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的一種較常見的原發(fā)性痛風(fēng)臨床類型[7]。由于嚙齒類、哺乳類動(dòng)物體內(nèi)尿酸代謝與人類差別較大，其體內(nèi)的尿酸酶將尿酸分解為尿囊素排出體外，體內(nèi)蓄積很少，也不會(huì)在組織內(nèi)沉積造成損害。因此，將嚙齒、哺乳類動(dòng)物造成動(dòng)物模痛風(fēng)性腎病模型較困難，即使造模成功，在其驗(yàn)證、評(píng)估藥物作用部位及機(jī)制或進(jìn)行高尿酸血癥發(fā)生機(jī)理研究時(shí)，均存在難以確定的藥物作用環(huán)節(jié)[8]，因此應(yīng)檢測(cè)與腎損傷相關(guān)的指標(biāo)來綜合評(píng)價(jià)模型的成功與否。

高劑量的酵母干擾機(jī)體正常的嘌呤代謝，導(dǎo)致體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，誘發(fā)高尿酸血癥。研究中有以單純酵母制作痛風(fēng)性腎病的動(dòng)物模型[9]。此方法符合人類原發(fā)性痛風(fēng)性腎病的發(fā)病機(jī)制。異常高濃度的腺嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)闃O難溶于水的2,8-二羥基腺嘌呤，沉積于腎小管，引起腎小管阻塞，進(jìn)而導(dǎo)致血清尿酸、肌酐、尿素氮顯著上升[9]。林若勤等[5]單純以腺嘌呤灌服法造成準(zhǔn)確的以腎小管損壞為主, 并見腎間質(zhì)、腎小動(dòng)脈病變的SD大鼠模型, 類似于人類的痛風(fēng)性腎病所致的腎臟繼發(fā)性病理基本變化。本實(shí)驗(yàn)采用聯(lián)合酵母和腺嘌呤法復(fù)制痛風(fēng)性腎病模型，既有原發(fā)性因素，又有繼發(fā)性因素，更接近于人類痛風(fēng)性腎病的發(fā)病機(jī)制。

腎臟肥大系數(shù)結(jié)合腎臟表面及內(nèi)部的肉眼觀察結(jié)果，可初步分析實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟的損傷程度。模型E組中β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)升高主要見于各種腎實(shí)質(zhì)性疾患引起的腎小管損傷，其升高程度與腎小管損傷程度呈正比[10]。實(shí)驗(yàn)中通過病理切片觀察，發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)性腎病引起腎臟損傷主要為腎皮質(zhì)中腎小管上皮細(xì)胞腫脹，導(dǎo)致腎小管功能受損，因此通過檢測(cè)腎皮質(zhì)NAG含量的高低評(píng)價(jià)模型的嚴(yán)重程度較為客觀。

大量的臨床研究證明，血清尿酸水平的升高與各種代謝疾病,包括痛風(fēng)、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病和代謝綜合征密切相關(guān)[11]。當(dāng)腎臟的腎小球?yàn)V過率下降至正常值的50%，血清尿素氮(BUN)才明顯增高，故以BUN來判斷早期腎小球的功能損傷并不靈敏。但在大量攝入高蛋白高嘌呤食物和消化道出血燒傷，嚴(yán)重感染，使用糖皮質(zhì)激素均可導(dǎo)致血尿素氮水平的升高[12]。酵母屬于高蛋白高嘌呤食物，大劑量酵母灌服大鼠，可導(dǎo)致BUN水平的升高，因此以BUN評(píng)價(jià)此模型的嚴(yán)重程度。臨床上測(cè)定肌酐水平主要用于評(píng)價(jià)腎臟功能的變化，有助于鑒別腎臟功能是否有改善或是處于潛在的衰竭狀態(tài)。血清中肌酐的測(cè)定對(duì)晚期腎臟疾病的鑒別診斷有重要作用[13]。

長(zhǎng)期以來研究者認(rèn)為，蛋白尿作為腎小球疾病最常見的臨床表現(xiàn)之一，可能僅反映腎小球損傷的程度[14]。但隨著研究的深入，蛋白尿作為眾多腎小球疾病的共同特點(diǎn)，不僅是腎小球損傷的指標(biāo)，長(zhǎng)期大量的蛋白尿還可引起腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)的損傷，進(jìn)而損害腎小球功能，促使疾病惡化。腎小管間質(zhì)損害是與長(zhǎng)期大量蛋白尿伴隨。目前較一致的觀點(diǎn)認(rèn)為，蛋白尿是通過引起腎小管間質(zhì)損害而影響腎臟疾病的進(jìn)展[15]。本次實(shí)驗(yàn)測(cè)定了各組大鼠的24 h尿蛋白含量，模型A、B組的24 h尿蛋白含量顯著升高，說明腎小球受損。而模型E、F組含量較模型A、B組低，結(jié)合病理結(jié)果分析為腎小管受損。

尿酸升高可促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒釋放中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)，尿酸鹽結(jié)晶可以刺激腎小管上皮細(xì)胞合成 NGAL，加速腎臟損傷，NGAL是尿酸性腎病導(dǎo)致的慢性腎損傷疾病中的早期標(biāo)志物[16]。通過免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿中NGAL蛋白的表達(dá)明顯高于正常組，表明痛風(fēng)性腎病大鼠腎臟的損傷受NGAL分泌的影響。 TIMP-1 主要在腎臟局部發(fā)揮特異性抑制作用，TIMP-1的表達(dá)失衡可促進(jìn)腎臟纖維化的進(jìn)程，是致纖維化的重要環(huán)節(jié)[17]。模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿中TIMP-1蛋白量的表達(dá)明顯多于正常組，說明TIMP-1蛋白的表達(dá)影響著痛風(fēng)性腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。有學(xué)者提出OAT1在尿酸鹽分泌的第一步，即從管周間隙攝取尿酸鹽入腎小管上皮細(xì)胞中起重要作用，OAT1的缺陷會(huì)引起血尿酸水平的升高，參與腎近曲小管對(duì)尿酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)[18]。模型組大鼠腎小管OAT1呈低表達(dá)和無表達(dá)，痛風(fēng)性腎病中尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OAT1其關(guān)鍵調(diào)控作用，其分泌的減少影響了痛風(fēng)性腎病的疾病進(jìn)程。

研制疾病的動(dòng)物模型要重視模型的病變程度應(yīng)符合于疾病的基本病理, 病理程度過輕或過重, 都不利于疾病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和藥物的篩選。本實(shí)驗(yàn)所得的模型E組，即100 mg/kg腺嘌呤和15 g/kg酵母共同造模8d誘導(dǎo)的大鼠痛風(fēng)性腎病模型準(zhǔn)確達(dá)到符合痛風(fēng)性腎病的基本病理要求，即腎臟病理主要集中在腎小管, 并累及腎間質(zhì)、腎小動(dòng)脈，以尿酸鹽結(jié)晶所引發(fā)的腎小管炎性變形態(tài)學(xué)病理過程變化，一般癥狀類似于人類痛風(fēng)性腎病的癥狀，腎功能指標(biāo)和相關(guān)酶的活性符合痛風(fēng)性腎病的生化變化。痛風(fēng)性腎病腎損傷受NGAL、TIMP-1和尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OAT1的調(diào)控。

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Comparison of the establishment of rat model of gouty nephropathy induced by yeast and adenine

LAN Lun-li, JIANG Bin, LIU Meng-chu, ZOU Xiao-hong, CAO Chen, ZENG Yuan-er, Pang Jia-ying

(Laboratory of Traditional Chinese Medicine Analysis, College of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

Objective To explore the effect of yeast and adenine administration in different doses and different duration on the establishment of rat models of gouty nephropathy. Methods Fifty-seven healthy male 2 months old Dawley rats (220-250 g) were used in this study. The rats of model groups were gavaged with 15 g/kg yeast and 50 mg/kg or 100 mg/kg adenine, for different number of days. The kidney hypertrophy index, kidney function, urine indexes, liver xanthine oxidase activity, N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG) content in the renal cortex, and the renal histology were detected. The pathological changes of renal tissue were examined along with detection of the expression of NGAL, OAT1 and TIMP-1 by immunohistochemical staining. Results The renal pathological changes were more obvious with the increasing yeast and adenine doses and time of modeling. Compared with the normal group, the renal histological changes in the group administered with 100 mg/kg adenine and 15 g/kg yeast for 8 days showed apparent inflammatory cell infiltration and swelling of tubular epithelial cells, but there was not destruction of renal tubules and glomerular structures, showing a significant difference between the model and normal groups (P< 0.01). Compared with that of the normal control group, kidney function was significantly decreased in the model groups A, B, E, and F (P< 0.01). Compared with the normal control group, the 24 h urine volume and content of urinary protein were significantly increased in the model groups A, B, E, and F (P<0.01), and the expressions of protein OAT1 were significantly reduced in the renal tubules, while expressions of NGA, TIMP-1 were increased in the model group E (P<0.01). Conclusions Administration of adenine at a dose of 100 mg/kg and yeast at 15 g/kg for 8 days is an ideal procedure for the establishment of a rat model of gouty nephropathy. The renal alterations of this rat model of gouty nephropathy are affected by the changes of expressions of NGAL, TIMP-1 and OAT1 protein expressions.

Gouty nephropathy; Yeast; Adenine; Kidney; Rat

南藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心專項(xiàng)基金(2011)。

藍(lán)倫禮，博士研究生，研究方向：中藥質(zhì)量分析。E-mail: lanlunli@yeah.net。

江濱，教授，研究方向：中藥質(zhì)量分析。E-mail: gzjiangbin@hotmail.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 02-0033-11

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.02.007

2016-11-16