大鼠細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1基因3?非編碼區(qū)雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建及rno-miR-15b-5p對(duì)其活性的影響

羅漢將，徐云峰，李曉曉，楊予濤，徐志卿

大鼠細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1基因3?非編碼區(qū)雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建及rno-miR-15b-5p對(duì)其活性的影響

羅漢將1，徐云峰2，李曉曉1，楊予濤1，徐志卿1

目的以大鼠細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ERK1)基因3?非編碼區(qū)(UTR)為研究對(duì)象，構(gòu)建含有ERK1基因3?UTR區(qū)的野生型以及突變型重組雙熒光素酶報(bào)告載體，通過(guò)分析雙熒光素酶報(bào)告載體的活性，明確rno-miR-15b-5p對(duì)報(bào)告載體的調(diào)節(jié)作用。方法采用miRNeasy Mini Kit提取大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞的總RNA，以PC12細(xì)胞的cDNA為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)將ERK1基因3?UTR克隆到pmiR-RB-ReportTMvector中。利用重疊延伸PCR，將ERK1基因3?UTR中的rno-miR-15b-5p潛在的靶序列TGCTGCT分別突變成CGAACGT和GTACACG，并將突變的ERK1基因3?UTR克隆到pmiR-RB-ReportTMvector中。結(jié)果成功構(gòu)建了包含ERK1基因3?UTR區(qū)的野生型報(bào)告載體pmiR-ERK13?UTR和突變型報(bào)告載體pmiR-ERK1-mut 3?UTR。利用熒光素酶活性檢測(cè)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)rno-miR-15b-5p mimic可以降低野生型報(bào)告載體的活性(P＜0.001)，但不影響突變型報(bào)告載體的活性。結(jié)論成功構(gòu)建ERK1基因3?UTR區(qū)野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告載體，初步證明ERK1基因3?UTR區(qū)是rno-miR-15b-5p的結(jié)合靶點(diǎn)。

rno-miR-15b-5p；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1；重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；pmiR-ERK13?UTR；pmiR-ERK1-mut 3? UTR；熒光素酶活性檢測(cè)

[本文著錄格式]羅漢將，徐云峰，李曉曉，等.大鼠細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1基因3?非編碼區(qū)雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建及rno-miR-15b-5p對(duì)其活性的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(2):166-172.

CITED AS:Luo HJ,Xu YF,Li XX,et al.Construction of rat extracellular signal-regulated kinase 1 gene 3?untranslated regions dual-luciferase reporter plasmids and effect of rno-mir-15b-5p on its activitiy[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(2):166-172.

抑郁癥是以顯著而持久的心境低落、思維遲緩、認(rèn)知功能障礙、意識(shí)活動(dòng)減退和軀體癥狀為主要臨床特征的精神疾病，但關(guān)于抑郁癥發(fā)生的具體分子機(jī)制仍不明確。有研究表明，microRNAs(miRNAs)很可能作為一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)影響突觸的可塑性、神經(jīng)的發(fā)生以及基因的表達(dá)，參與抑郁癥發(fā)生[1]。

miRNAs是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)堿基的非編碼小片段單鏈RNA，是人類非編碼RNA中種類最多的一種。到目前為止，在動(dòng)、植物以及病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有28,645個(gè)miRNAs分子，且有新的miRNA被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)[2]。miRNAs在動(dòng)、植物中主要參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，通過(guò)作用于靶基因3?端非編碼區(qū)(untranslated regions,UTR)的特定序列，切割降解靶基因的mRNA分子，調(diào)節(jié)靶基因的翻譯，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)效應(yīng)[3]。已有研究資料顯示，超過(guò)60%哺乳類動(dòng)物基因受到miRNAs的調(diào)節(jié)[4]。

miRNAs參與多種生物學(xué)過(guò)程，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和新陳代謝均起著重要的調(diào)節(jié)作用[5-8]。此外，在許多的病理過(guò)程如神經(jīng)精神疾病[9]、腫瘤[10]及心血管病[11]中，都存在miRNAs表達(dá)異常的現(xiàn)象。

miR-15b是miR-15前體家族中的一員，參與調(diào)節(jié)腫瘤和骨骼的發(fā)生及分化等過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，miR-15b可能作為一種成骨細(xì)胞的正向調(diào)節(jié)子，通過(guò)減少SmurfI介導(dǎo)的Runx2蛋白降解來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[12]。miR-15b也被證實(shí)通過(guò)影響細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[13]。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(extracellular signal-regulated kinase 1,ERK1)是由ERK1基因編碼的產(chǎn)物，是絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族的一員，是Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分[14]。研究表明，ERK1主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、遷移、存活、增殖、分化以及新陳代謝等多種生理過(guò)程[15]，是多種信號(hào)通路共有的下游成分之一。此外，ERK1也參與多種病理學(xué)進(jìn)程，許多原癌基因編碼的蛋白可通過(guò)ERK信號(hào)通路來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞學(xué)效應(yīng)[16]。ERK信號(hào)通路的持續(xù)激活可以加速誘發(fā)腫瘤[17]，但敲除ERK1基因的小鼠胸腺發(fā)育則存在障礙[18]。近期的一些研究表明，ERK信號(hào)通路也參與抑郁癥的發(fā)生[9]。

我們通過(guò)miRNAs、TargetScan、miRBase等生物信息學(xué)在線網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，大鼠ERK1基因的3?UTR區(qū)域存在與rno-miR-15b-5p互補(bǔ)配對(duì)的堿基序列，初步推測(cè)ERK1基因是rno-miR-15b-5p潛在的作用靶點(diǎn)。

本研究以大鼠ERK1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)克隆ERK1基因3?UTR區(qū)，并突變其與rno-miR-15b-5p作用的靶序列，構(gòu)建ERK1基因3?UTR野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告載體，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析rno-miR-15b-5p mimic對(duì)含有野生型及突變型ERK1基因3?UTR的雙熒光素酶報(bào)告載體活性的影響，初步確定rno-miR-15b-5p對(duì)ERK1基因的調(diào)節(jié)作用。該研究可為后續(xù)研究rno-miR-15b-5p通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1基因的表達(dá)而影響大鼠的抑郁樣行為奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌DH5ɑ菌株、大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

miRNeasy Mini Kit：QIAGEN，德國(guó)。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit：ROCHE，瑞士。Q5 High-Fidelity DNA polymerase、XhoI內(nèi)切酶、NotI內(nèi)切酶、Gel loading dye blue(6X)、T4 DNA連接酶：NEB，美國(guó)。DNA marker III：TIANGEN，中國(guó)。NucleoSpin?Gel and PCR Clean-up：MN，德國(guó)。E.Z. N.A.Plasmid Mini Kit I：OMEGA，美國(guó)。micrONTM miRNA mimic、pmiR-RB-ReportTMvector：RIBOBIO，中國(guó)。LipofectamineTM2000 Regent：INVITROGEN，美國(guó)。Dual-Luciferase?Reporter Assay System：PROMEGA，美國(guó)。Yeast Extract Powder、Tryptone、Agar Powder：USB，美國(guó)。NaCl：分析純，中國(guó)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀：TECHNE，英國(guó)。低溫高速離心機(jī)：EPPENDORF，德國(guó)。NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)：THERMO，美國(guó)。PYY-7C恒壓恒流電泳儀：北京六一儀器廠。MLS-3750高壓滅菌鍋：SANYO，日本。DK-S22恒溫水浴箱：北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司。AlphaImage凝膠成像系統(tǒng)：HP，美國(guó)。Glommax 20/20 Luminometer檢測(cè)儀：PROMEGA，美國(guó)。

1.2 方法

1.2.1 基因序列的獲取與miRNAs靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用GenBank得到大鼠ERK1基因的3?UTR序列。通過(guò)miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRBase(http://www.mirbase. org/)、microRNA(http://www.microrna.org/)預(yù)測(cè)與大鼠ERK1基因3?UTR區(qū)結(jié)合的miRNAs。

1.2.2 PC12細(xì)胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增

PC12細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，利用miRNeasy Mini Kit提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)NanoDrop 2000測(cè)得RNA濃度，利用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄總RNA 1 μg，獲得大鼠cDNA。根據(jù)GenBank中ERK1基因的3?UTR序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增其3? UTR的上游引物F-ERK和下游引物R-ERK(見(jiàn)表1)，以大鼠PC12細(xì)胞的cDNA作為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包含有5×Q5 Reaction Buffer 5 μl、5×Q5 High GC Enhancer Buffer 5 μl、2.5 mmol/L dNTPs 2 μl、10 μmol/L上下游引物各1.25 μl、模板cDNA 0.5 μl、Q5 High-Fidelity DNA polymerase 0.25 μl、ddH2O 9.25 μl。擴(kuò)增條件為98℃預(yù)變性30 s、98℃變性10 s、55℃退火10 s、72℃延伸20 s，共進(jìn)行32個(gè)循環(huán)后，72℃后延伸2 min。擴(kuò)增完成后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并采用NucleoSpin?Gel and PCR Clean-up試劑盒純化回收目的區(qū)域PCR產(chǎn)物。

1.2.3 野生型重組雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

用XhoI內(nèi)切酶和NotI內(nèi)切酶分別對(duì)上述擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和pmiR-RB-ReportTMvector載體進(jìn)行雙酶切，純化回收目的片段，然后用T4 DNA連接酶室溫連接2 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5ɑ中，37℃恒溫培養(yǎng)12～16 h，第2天進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定，將陽(yáng)性克隆送北京奧科鼎盛科技有限公司測(cè)序，測(cè)序正確的克隆命名為pmiR-ERK13?UTR。

1.2.4 突變型重組雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

利用microRNA、TargetScan、miRBase等預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)ron-miR-15b-5p與ERK1基因3?UTR結(jié)合的靶序列，將ERK1基因3?UTR中第242～248位堿基TGCTGCT(L1)突變?yōu)镃GAACGT(M1)，將第501～507位堿基TGCTGCT(L2)突變?yōu)镚TACACG(M2)。針對(duì)L1位點(diǎn)設(shè)計(jì)突變引物MF1和MR1；針對(duì)L2位點(diǎn)設(shè)計(jì)突變引物MF2和MR2(見(jiàn)表1)。

以構(gòu)建好的野生型pmiR-ERK13?UTR質(zhì)粒為模板，利用重疊延伸PCR進(jìn)行堿基突變。針對(duì)L1位點(diǎn)的突變，需要進(jìn)行兩組PCR。第一組PCR以MF1和R-ERK為引物進(jìn)行擴(kuò)增，第二組PCR以F-ERK和MR1為引物進(jìn)行擴(kuò)增。將上述兩組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳回收后，取等體積混合，以此為模板，利用F-ERK和R-ERK引物，進(jìn)行重疊延伸PCR。將PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳回收，送北京奧科鼎盛科技有限公司測(cè)序，分析目的序列L1是否突變成功。

針對(duì)L2位點(diǎn)的突變，以L1位點(diǎn)突變成功的PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行兩組PCR，以F-ERK和MR2為引物的作為第一組，以MF2和R-ERK為引物的作為第二組。將兩組PCR產(chǎn)物電泳回收后，取等體積混合，以此為模板，以F-ERK和R-ERK為引物，再次進(jìn)行重疊延伸PCR。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，送北京奧科鼎盛科技有限公司測(cè)序，分析目的序列L2是否突變成功。將L1和L2位點(diǎn)均得到突變的PCR產(chǎn)物克隆到pmiR-RB-ReportTMvector載體中，并將其命名為pmiR-ERK1-mut 3?UTR。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用LipofectamineTM2000 Regent轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，方法根據(jù)試劑盒中說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前1 d，將PC12細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)孔中接種5×104個(gè)細(xì)胞，用含15%馬血清和2.5%胎牛血清的F-12K Nutrient Mixture培養(yǎng)液500 μl培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，給細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)液。每個(gè)孔轉(zhuǎn)染100 ng重組質(zhì)粒以及終濃度為100 nmol/L的micrONTM miRNA-15b-5p mimic或其Negative control(NC)中的一種。用Opti-MEM?I Reduced Serum Medium(OMEM)配制轉(zhuǎn)染混合液，取兩個(gè)1.5 ml的EP管，各加入OMEM 25 μl，其中一管加入重組質(zhì)粒100 ng及100 nmol/L miR-15b-5p mimic或NC，另一管加入LipofectamineTM2000 Regent 2 μl。各自混勻后靜置5 min，隨后將兩者混勻后室溫靜置20 min制成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將上述轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻地滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中。轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞，進(jìn)行下一步熒光素酶活性檢測(cè)。上述實(shí)驗(yàn)中，每組設(shè)置3個(gè)平行副孔，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 雙熒光素酶活性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)依據(jù)Dual-Luciferase?Reporter Assay System檢測(cè)熒光素酶活性。將轉(zhuǎn)染48 h后的PC12細(xì)胞用PBS洗滌2次，用Passive Lysis Buffer 100 μl裂解細(xì)胞20 min，隨后用Glommax 20/20 Luminometer檢測(cè)儀檢測(cè)。測(cè)量管中加LAR II試劑50 μl以及細(xì)胞裂解液10 μl，測(cè)定讀數(shù)記為熒光值1；再加入Stop&Glo reagent試劑50 μl，測(cè)定讀數(shù)記為熒光值2，以熒光值2/熒光值1的比值作為相對(duì)熒光素酶活性。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多因素方差分析檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以(±s)表示。顯著性水平ɑ=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

大鼠ERK1基因是rno-miR-15b-5p的潛在靶基因之一，rno-miR-15b-5p與ERK1基因結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖1。

2.2ERK13?UTR目的片段的擴(kuò)增

以大鼠PC12細(xì)胞cDNA為模板，以F-ERK和R-ERK分別為上下游引物，利用Q5 High-Fidelity DNApolymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為600 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)，與預(yù)期大小一致。

2.3 野生型重組雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

將上一步擴(kuò)增產(chǎn)物及pmiR-RB-ReportTMvector用XhoI和NotI進(jìn)行雙酶切處理，電泳回收ERK1基因3? UTR片段和線性載體片段，經(jīng)T4連接酶連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ。將菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的3個(gè)克隆進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，3個(gè)陽(yáng)性克隆均切出大小約為6200 bp和600 bp的片段(圖3)，初步證明重組載體構(gòu)建成功。將上述3個(gè)克隆分別測(cè)序，發(fā)現(xiàn)插入片段與大鼠ERK1基因3? UTR序列均一致，表明pmiR-ERK13?UTR野生型質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 突變型重組雙熒光素酶報(bào)告載體的構(gòu)建

由于ERK1基因3?UTR存在兩個(gè)部分與rno-miR-15b-5p互補(bǔ)配對(duì)的靶序列L1和L2(圖1)，需要進(jìn)行兩輪突變。第一輪：以上一步構(gòu)建成功的野生型pmiR-ERK13?UTR重組質(zhì)粒作為模板，以MF1和R-ERK以及F-ERK和MR1作為兩對(duì)突變引物分別進(jìn)行針對(duì)L1位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增，得到大小約為367 bp和260 bp的PCR產(chǎn)物(圖4A)；將兩部分PCR產(chǎn)物回收純化，等比例混合后，作為模板，以F-ERK和R-ERK作為上下游引物，進(jìn)行重疊延伸PCR，得到大小約為594 bp的產(chǎn)物(圖4B)。將重疊延伸PCR產(chǎn)物回收后送北京奧科鼎盛科技有限公司測(cè)序，與ERK13?UTR進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)L1成功突變成M1。第二輪：以第一輪突變PCR產(chǎn)物作為模板，以F-ERK和MR2以及MF2和R-ERK作為兩對(duì)突變引物進(jìn)行針對(duì)L2的突變反應(yīng)，得到大小約為518 bp和109 bp的PCR產(chǎn)物(圖4C)；將兩部分PCR產(chǎn)物回收純化，等比例混合后作為模板，以F-ERK和R-ERK作為上下游引物，進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增，得到大小約為594 bp的PCR產(chǎn)物(圖4D)，并將該P(yáng)CR產(chǎn)物測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該P(yáng)CR產(chǎn)物中的L1和L2位點(diǎn)均突變成功。

將L1和L2位點(diǎn)均突變的PCR產(chǎn)物以及pmiR-RB-ReportTMvector用XhoI和NotI進(jìn)行雙酶切處理，得到ERK1-mut 3?UTR片段和線性載體片段，通過(guò)T4連接酶，將突變片段克隆到pmiR-RB-ReportTMvector載體中。對(duì)菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的3個(gè)克隆進(jìn)行酶切分析，發(fā)現(xiàn)上述3個(gè)克隆酶切后均產(chǎn)生兩條亮帶(圖4E)，大小約為6200 bp和600 bp，與預(yù)期大小一致。將上述3個(gè)克隆分別測(cè)序，發(fā)現(xiàn)L1和L2位點(diǎn)均突變成功，見(jiàn)圖5。表明pmiR-ERK1-mut 3?UTR突變型質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.5 野生型和突變型重組報(bào)告載體的活性檢測(cè)

將正確構(gòu)建的pmiR-ERK13?UTR或pmiR-ERK1-mut 3?UTR重組報(bào)告質(zhì)粒與micrONTM miRNA-15b-5p mimic或NC分別共轉(zhuǎn)染至PC12細(xì)胞中，利用Dual-Luciferase?Reporter Assay System的方法檢測(cè)其熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)rno-miR-15b-5p mimic可以明顯下調(diào)野生型pmiR-ERK13?UTR報(bào)告載體活性，而對(duì)突變型pmiR-ERK1-mut 3?UTR報(bào)告載體活性無(wú)影響(圖6)。

圖1 rno-miR-15b-5p與ERK1基因的結(jié)合模式圖

圖2 ERK13?UTR的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pmiR-ERK13?UTR的酶切鑒定

圖4 pmiR-ERK1-mut 3?UTR突變型載體的構(gòu)建

圖5 野生型和突變型載體部分測(cè)序分析圖

圖6 rno-miR-15b-5p mimic/NC對(duì)野生型和突變型重組熒光素酶報(bào)告載體活性的影響

3 討論

根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，miRNAs通過(guò)與特定基因mRNA的部分堿基序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)而影響目的基因mRNA的表達(dá)水平及后續(xù)翻譯過(guò)程。在神經(jīng)系統(tǒng)中，miRNAs也具有廣泛的表達(dá)，參與多種生物學(xué)過(guò)程。研究顯示，miR-137的過(guò)量表達(dá)可以促進(jìn)成年神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，而敲減其表達(dá)則增強(qiáng)其分化[19]。miR-15b可以通過(guò)減緩細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[13]。miR-124的異位表達(dá)可導(dǎo)致神經(jīng)元早熟及生成的增多，而敲減其表達(dá)則導(dǎo)致腦室下區(qū)干細(xì)胞仍然處于未分化狀態(tài)[20]。此外，研究顯示，miRNAs也參與了突觸的形成和發(fā)育過(guò)程，影響突觸可塑性[21]。

ERK1/2主要被各種生長(zhǎng)因子、離子射線、過(guò)氧化氫等磷酸化而激活，進(jìn)入細(xì)胞核，通過(guò)修飾轉(zhuǎn)錄因子，影響基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。ERK1/2與細(xì)胞的增殖及分化關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)一些與增殖有關(guān)的信號(hào)分子可以通過(guò)與酪氨酸激酶受體[22]、G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)[23]、離子通道[24]等蛋白的相互作用而激活膜上Ras蛋白。GTP結(jié)合的Ras蛋白則可以激活蛋白激酶Raf-1，B-Raf，A-Raf (Rafs)[25]。Rafs可以通過(guò)磷酸化MEK1/2[26]，進(jìn)一步激活下游的ERK1/2，而ERK1/2的激活可以調(diào)節(jié)Elk1[27]、c-Fos[28]和c-Jun[29]等轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化水平，最終影響細(xì)胞的增殖和分化。

研究表明ERK1/2與疾病的發(fā)生也有密切的關(guān)系。在阿爾茨海默病模型小鼠海馬中，ERK1/2的表達(dá)存在異常[30]。在抑郁癥患者[31]和慢性溫和不可預(yù)期應(yīng)激模型大鼠[32]海馬中，ERK1/2的磷酸化水平明顯降低。

為了研究在抑郁癥中miR-15b和ERK1兩者之間的關(guān)系，本研究利用microRNA、TargetScan、miRBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，rno-miR-15b-5p存在與靶基因ERK1基因3?UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)的結(jié)合位點(diǎn)，并以此為基礎(chǔ)，利用PCR成功得到ERK1 3?UTR及其與rno-miR-15b-5p結(jié)合位點(diǎn)突變的ERK1-mut 3?UTR，成功構(gòu)建其野生型和突變型的雙熒光素酶報(bào)告載體。

本研究選用的載體pmiR-RB-ReportTM是專門用來(lái)檢測(cè)miRNAs與mRNA相互作用的工具，通過(guò)將目的基因的3?UTR區(qū)克隆至海腎熒光素酶基因(hRluc)下游位點(diǎn)，以海腎熒光素酶基因作為報(bào)告基因，以螢火蟲(chóng)熒光素酶基因(hluc)作為內(nèi)參基因，通過(guò)檢測(cè)海腎熒光素酶活性的相對(duì)變化來(lái)鑒定miRNAs對(duì)該基因是否具有調(diào)控作用。由于該載體同時(shí)包含報(bào)告基因和內(nèi)參基因，因此減少了共轉(zhuǎn)基因造成的實(shí)驗(yàn)誤差，使得內(nèi)參校準(zhǔn)更加可靠。

本研究通過(guò)靶基因雙向預(yù)測(cè)、目的基因片段的克隆、重組以及突變等技術(shù)成功地構(gòu)建了應(yīng)用于miRNA靶基因檢測(cè)的野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告載體pmiR-ERK1 3?UTR和pmiR-ERK1-mut 3?UTR。隨后，利用rno-miR-15b-5p mimic與pmiR-ERK1 3?UTR或pmiR-ERK1-mut 3?UTR共轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)rno-miR-15b-5p mimic可以明顯下調(diào)pmiR-ERK1 3?UTR的熒光素酶活性，表明大鼠ERK1基因是rno-miR-15b-5p的作用靶點(diǎn)。本研究為下一步深入探討rno-miR-15b-5p與ERK1在抑郁癥發(fā)病過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of Rat Extracellular Signal-regulated Kinase 1 Gene 3?Untranslated Regions Dual-luciferase Reporter Plasmids and Effect of rno-miR-15b-5p on ItsActivitiy

LUO Han-jiang1,XU Yun-feng2,LI Xiao-xiao1,YANG Yu-tao1,XU Zhi-qing1
1.Captial Medical University School of Basic Medical Sciences,Beijing 100069,China；2.Huangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Qingdao,Shandong 266555,China

YANG Yu-tao,XU Zhi-qing.E-mail:yutaoy@ccmu.edu.cn(YANG Yu-tao),zhiqingx@ccmu.edu. cn(XU Zhi-qing)

ObjectiveTo construct dual-luciferase reporter plasmids containing the wild type and mutant rat extracellular signal-regulated kinase 1(ERK1)gene 3?untranslated regions(UTR)which were used to detect rno-miR-15b-5p's putative target gene.MethodsThe ratERK1gene 3?UTR fragment was amplified by polymerase chain reaction(PCR)from PC12 cell cDNA and cloned into pmiR-RB-ReportTMvector.The mutant ratERK1gene 3?UTR fragment was obtained by overlap PCR and inserted into pmiR-RB-ReportTMvector.Successful wild type and mutant recombinant plasmids were confirmed by DNAsequencing.PC12 cells were co-transfected with rno-miR-15b-5p mimic and pmiR-ERK13?UTR or pmiR-ERK1-mut 3?UTR and then analyzed by dual-luciferase reporter assay system.The achieved mutation sequence of the target site TGCTGCT was mutated to CGAACGT and GTACACG,respectively.ResultsThe wild-type reporter vector pmiR-ERK13?UTR and the mutant reporter vector pmiR-ERK1-mut 3?UTR were successfully constructed.The rno-miR-15b-5p mimic decreased the activity of pmiR-ERK13?UTR plasmid(P＜0.001)but did not decrease the activity of pmiR-ERK1-mut 3?UTR plasmid.ConclusionThe recombinant pmiR-ERK13?UTR and pmiR-ERK1-mut 3?UTR plasmids were constructed successfully,and luciferase activities demonstrated that the 3?UTR ofERK1gene might be a potential target of rno-miR-15b-5p.

rno-miR-15b-5p；extracellular signal-regulated kinase 1；overlap polymerase chain reaction；pmiR-ERK13?UTR；pmiR-ERK1-mut 3?UTR；luciferase reporter assay

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.02.010

R749.4

A

1006-9771(2017)02-0166-07

2016-09-05

2016-09-18)

1.北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.7162016)；2.國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.31271154；No.31171032)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京市100069；2.黃島出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島市266555。作者簡(jiǎn)介：羅漢將(1990-)，男，漢族，浙江余姚市人，碩士研究生，主要研究方向：miR-15b參與抑郁癥發(fā)生的機(jī)制研究。通訊作者：楊予濤(1972-)，男，博士，副教授，主要研究方向：抑郁癥的發(fā)病機(jī)制；徐志卿(1963-)，男，博士，教授，主要研究方向：神經(jīng)遞質(zhì)受體和重大腦病。E-mail:yutaoy@ccmu.edu.cn(楊予濤)；zhiqingx@ccmu.edu.cn(徐志卿)。