阿維拉霉素提取工藝的研究

閔江，劉正光，梁景樂，趙學(xué)朋，馬傳亮，趙才兵

（山東勝利生物工程有限公司 山東濟(jì)寧 272000）

阿維拉霉素是由綠色產(chǎn)色鏈霉素菌發(fā)酵而生成的二氯異扁枝衣酸酯，屬于正糖霉素族寡糖類抗生素[1]，可用作豬和肉雞的飼料添加劑，提高豬和肉雞的平均日增重和飼料報(bào)酬率[2]，也可抑制革蘭氏陽性菌，通過與細(xì)菌核糖體結(jié)合來抑制蛋白質(zhì)的合成[3]，達(dá)到預(yù)防動(dòng)物疾病的效果。因其安全性高，殘留率低，對環(huán)境無影響等特點(diǎn)，在世界大部分國家和地區(qū)得到廣泛應(yīng)用。

目前國內(nèi)尚無廠家生產(chǎn)阿維拉霉素，該生產(chǎn)技術(shù)被美國禮來公司壟斷，該公司生產(chǎn)的阿維拉霉素預(yù)混劑（10%）和阿維拉霉素預(yù)混劑（20%）已經(jīng)獲批進(jìn)入中國市場。國內(nèi)關(guān)于阿維拉霉素的研究在菌種選育、誘變方面和發(fā)酵過程方面較多，鮮有阿維拉霉素提取工藝相關(guān)研究。Mertz JL等[4]用丙酮做溶劑浸提阿維拉霉素干菌絲體，浸提液進(jìn)行脫色漂白，之后加水析出阿維拉霉素晶體，將晶體過濾后，再用乙腈-水重結(jié)晶后，過濾、干燥，通過液相色譜分離得到阿維拉霉素純品。王宏等[5]以有機(jī)溶劑浸提含阿維拉霉素的菌絲體，通過結(jié)晶、硅膠柱層析、ODS柱洗脫分離、重結(jié)晶，抽濾后結(jié)晶用純水漂洗，烘干獲得阿維拉霉素純品。程豪[6]將阿維拉霉素發(fā)酵液經(jīng)過預(yù)處理、過濾和烘干得阿維拉霉素干菌絲，將阿維拉霉素干菌絲在一定溫度下加入有機(jī)溶劑攪拌，過濾得浸提液，將其減壓蒸餾得到濃縮浸漬液，然后浸漬液脫色，低溫結(jié)晶得到阿維拉霉素成品，此工藝可有效提高阿維拉霉素有效組分A、B的含量。袁宗輝等[7]以有機(jī)溶劑浸提阿維拉霉素，浸提液減壓蒸干后得到阿維拉霉素粗品，然后使用一定比例的丙酮-水、乙醇-水重結(jié)晶多次，可得白色的阿維拉霉素純品，但此法繁瑣，收率偏低。鑒于此，筆者對阿維拉霉素提取工藝進(jìn)行了研究，可為工業(yè)化生產(chǎn)阿維拉霉素提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以此填補(bǔ)國內(nèi)空白。

1 材料與方法

1.1 原料

AVL201606006批阿維拉霉素發(fā)酵液由山東勝利生物工程有限公司提供。

1.2 主要試劑

4-甲基-2-戊酮（分析純，上海冀軋實(shí)業(yè)有限公司）；正己烷（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC，J.T.Baker）；甲醇（HPLC，J.T.Baker）；氫氧化鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫銨（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 主要儀器

液相色譜儀Agilentl200（Agilent公司，美國）；FW-100型萬能粉碎機(jī) (上海楚定分析儀器有限公司)；JA31002型電子天平 (上海越平科學(xué)儀器有限司)；KDM型調(diào)熱電熱套 (山東鄄城光明儀器有限公司)；Heidolph4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (海道夫，德國)；DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 (鄭州長盛實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；xutemp型低溫恒溫液浴循環(huán)兩用槽 (杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 阿維拉霉素干菌絲體制備 發(fā)酵結(jié)束后，取適量發(fā)酵液，攪拌均勻，加熱至90℃保溫15min，然后降溫至50～60℃，用氫氧化鈉溶液將發(fā)酵液pH值調(diào)至8.0-8.5之間?；靹蚝笤僦匦聹y定，以保證過濾過程中pH值維持在8.0-8.5之間，減壓過濾，得到的阿維拉霉素濕菌絲體，放在真空干燥箱中烘干，粉碎，備用。

1.4.2 阿維拉霉素提取工藝 取適量阿維拉霉素干菌絲體，用干菌絲體重量7倍體積的4-甲基-2-戊酮溶解，在80℃下提取1h，減壓過濾，得一浸液；將得到一浸濕菌渣用干菌絲體重量5倍體積的4-甲基-2-戊酮溶解，在80℃下提取1h，減壓過濾，得二浸液；合并一浸液與二浸液，在真空度為0.09MPa，溫度為70℃的水浴條件下減壓濃縮至浸提液體積的1/3，濃縮液冷卻后加入2倍體積正己烷，機(jī)械攪拌1h后減壓過濾，得到阿維拉霉素濕精粉，放在真空度為0.09MPa，溫度為60℃的真空干燥箱中干燥2h，得到白色阿維拉霉素純品。

1.4.3 阿維拉霉素效價(jià)的檢測 ①對照品溶液的制備：取阿維霉素對照品適量（約相當(dāng)于阿維霉素40mg），置100mL量瓶中，加丙酮10mL使溶解，再用乙腈-0.132%磷酸氫二銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至7.0）（50∶50）稀釋至刻度，制成約含0.4mg/mL的溶液。②供試品溶液的制備：精確稱量阿維拉霉素0.02g，放入100mL容量瓶中加入適量丙酮，溶解后用丙酮定容，搖勻、過濾、備用。③色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.2%磷酸二氫銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）（51∶49）為流動(dòng)相；檢測波長為214nm，進(jìn)樣量10μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 4-甲基-2-戊酮對阿維拉霉素溶解能力

在 25℃、40℃、60℃、70℃、80℃、90℃條件下，各取10g阿維拉霉素溶于100mL4-甲基-2-戊酮中，檢測阿維拉霉素溶液效價(jià)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。可以看出，溫度越高，4-甲基-2-戊酮溶解的阿維拉霉素量越多。

表1 不同溫度下阿維拉霉素在4-甲基-2-戊酮中的溶解度

2.2 浸提溫度的選擇

取適量阿維拉霉素菌絲體，分別在25℃、40℃、60℃、80℃下用4倍體積4-甲基-2-戊酮一次浸提；一浸濕菌渣用2倍體積4-甲基-2-戊酮二次浸提，檢測一次浸提液、二次浸提液和干菌渣效價(jià)，浸提收率見表2?？梢钥闯觯釡囟葘Υ斯に嚨挠绊懮醮?，溫度越高，提取收率越高，菌渣中殘留的阿維拉霉素較少，考慮到安全與動(dòng)力消耗問題，擬選用80℃作為浸提溫度。

表2 不同溫度下4-甲基-2-戊酮浸提阿維拉霉素收率

2.3 浸提時(shí)間選擇

取適量阿維拉霉素菌絲體，在80℃下用4倍體積4-甲基-2-戊酮一次浸提；一浸濕菌渣用2倍體積4-甲基-2-戊酮二次浸提，分別在0.5h、1h、2h取樣檢測浸提液效價(jià)，浸提收率見表3?？紤]到時(shí)間成本與浸提率，兩次浸提時(shí)間都可以選用1h。

表3 不同浸提時(shí)間對浸提率的影響

2.4 浸提料液比選擇

在80℃條件下，比較不同料液比(m/v)對浸提率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4?？梢钥闯?，阿維拉霉素菌絲體一次浸提與二次浸提時(shí)，4-甲基-2-戊酮的使用量越多，浸提率越高，菌渣中殘留的阿維拉霉素越少。考慮到溶劑消耗成本、溶劑套用情況、菌渣殘留、生產(chǎn)設(shè)備承受能力等情況，確定一次浸提料液比為1∶7，二次浸提料液比為1∶5。

表4 不同料液比對浸提率的影響

2.5 濃縮液體積選擇

阿維拉霉素兩次浸提液合并后，需減壓濃縮。本實(shí)驗(yàn)考察了濃縮倍數(shù)對制得阿維拉霉素產(chǎn)品質(zhì)量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5?？梢钥闯?，浸提液濃縮倍數(shù)較大時(shí)，制得的阿維拉霉素產(chǎn)品質(zhì)量較差，顏色較黃；綜合考慮，V浸提液∶V濃縮液為 3∶1。

表5 不同用量正己烷對阿維拉霉素產(chǎn)品質(zhì)量影響

2.6 正己烷用量選擇

阿維拉霉素浸提液經(jīng)過濃縮后，需加入正己烷除油析晶。研究發(fā)現(xiàn)，正己烷用量對制得阿維拉霉素產(chǎn)品質(zhì)量有一定影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6?？梢钥闯觯和橛昧枯^少時(shí)，除油效果并不理想，制得的阿維拉霉素產(chǎn)品顏色較黃，效價(jià)偏低；當(dāng)V正己烷：V濃縮液為2∶1或3∶1時(shí)，所得阿維拉霉素產(chǎn)品性狀與效價(jià)相近。綜合考慮，V正己烷∶V濃縮液為2∶1。

表6 不同用量正己烷對阿維拉霉素產(chǎn)品質(zhì)量影響

表7 阿維拉霉素制備工藝三批驗(yàn)證結(jié)果

2.7 工藝驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)還對此工藝進(jìn)行了三批驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7?？梢钥闯觯ㄟ^此工藝浸提阿維拉霉素菌絲體收率較高，制得的阿維拉霉素純品含量在1,200U/mg左右，收率在85%以上。

3 結(jié)論

通過對浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比、濃縮液體積、正己烷用量等單因素研究，確定了阿維拉霉素提取的最佳工藝：浸提溫度為80℃；兩次浸提時(shí)間都為1h；一次浸提料液比為1∶7，二次浸提料液比為 1∶5；V浸提液∶V濃縮液為 3∶1；V正己烷∶V濃縮液為2∶1。并對此工藝進(jìn)行了三批驗(yàn)證，結(jié)果表明此工藝制得的阿維拉霉素含量和產(chǎn)品收率較高。另外，此工藝所用的有機(jī)溶劑均可回收利用，對環(huán)境污染較小，能耗及成本較低，操作簡單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)?！?/p>