ELISA技術(shù)在家畜疫病診斷中的應(yīng)用

李茂寧 ，謝麗華 ＊，韋達(dá)有 ，韋邦偉 ，韋紹婉 ，唐薇薇

（1.桂林市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西桂林市，541000；2.梧州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西梧州市，543002）

ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）是以酶作為標(biāo)記物，以抗原和抗體之間免疫結(jié)合和顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定方法。該技術(shù)具有快速準(zhǔn)確、儀器較廉價(jià)、適合大批量樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，在各領(lǐng)域及各級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用[1，2]。家畜疫病診斷主要內(nèi)容包括豬牛羊口蹄疫（O 型、I型和 A 型）[3]、豬藍(lán)耳病[4]、豬瘟[5]、豬偽狂犬病[6]、羊小反芻獸疫[7]的抗體檢測(cè)。本文對(duì)ELISA技術(shù)在上述家畜疫病診斷中涉及的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、試劑盒選擇、影響因素及常見問題進(jìn)行介紹，供廣大實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員參考。

1 ELISA技術(shù)簡(jiǎn)介

1.1 技術(shù)原理

已知抗原與待測(cè)抗體（或已知抗體與待測(cè)抗原）的結(jié)合反應(yīng)在固相支持物上進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)果的判斷以酶與底物作用后的顯色反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)，顯色強(qiáng)度與標(biāo)本中待測(cè)物濃度成正比或反比關(guān)系。顯色后的有色產(chǎn)物經(jīng)酶標(biāo)儀讀取OD值來計(jì)算和判定結(jié)果。

1.2 技術(shù)特點(diǎn)

1.2.1 免疫活性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動(dòng)態(tài)平衡，反應(yīng)式：Ag（抗原）+Ab（抗體）→Ag·Ab（復(fù)合物）。抗原或抗體在體外結(jié)合到某種固相載體表面后或解離后，仍然能保持其免疫學(xué)活性。

1.2.2 特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間，化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。

1.2.3 敏感性 酶具有很高的催化效率，可放大抗原抗體反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感性，一般可以達(dá)到μg/mL-ng/mL級(jí)。

1.3 基本類型 以檢測(cè)抗體為例，分為三種類型。①間接ELISA：利用酶標(biāo)記的抗抗體（二抗）檢測(cè)已與固相抗原結(jié)合的待測(cè)抗體。②雙夾心ELISA：用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法不同，雙夾心法以酶標(biāo)特異性抗原代替酶標(biāo)抗抗體。③競(jìng)爭(zhēng)ELISA：用已知抗原包被酶標(biāo)板，然后同時(shí)加入已知的抗體和待檢抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合包被的抗原（兩個(gè)抗體競(jìng)爭(zhēng)一個(gè)抗原）。

2 家畜疫病ELISA診斷方法

口蹄疫（O型、I型和A型）、豬藍(lán)耳病、豬瘟、豬偽狂犬、小反芻獸疫抗體檢測(cè)均有國(guó)際貿(mào)易指定或替代方法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)分別為GB/T 18935—2003口蹄疫診斷技術(shù)、GB/T18090—2008豬繁殖與呼吸綜合診斷方法、GB/T16551—2008豬瘟診斷技術(shù)、GB/T18641—2002偽狂犬病診斷技術(shù)、GB/T 27982—2011小反芻獸疫診斷技術(shù)。此外，還有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)如NY/T678—2003豬偽狂犬病免疫酶試驗(yàn)方法，或農(nóng)業(yè)部公布的上述病種防治技術(shù)規(guī)范中的診斷方法如豬瘟防治技術(shù)規(guī)范豬瘟抗體阻斷ELISA檢測(cè)法。

ELISA酶標(biāo)板包被的抗原或抗體不同成分，決定了不同用途?？谔阋呓Y(jié)構(gòu)蛋白VP用于血清型和免疫抗體檢測(cè)，非結(jié)構(gòu)蛋白NSP用于通用型和感染抗體檢測(cè)；豬藍(lán)耳病核衣殼蛋白（N蛋白）不能誘導(dǎo)產(chǎn)生病毒中和抗體，不適合用于對(duì)疫苗免疫效果監(jiān)測(cè)，而是側(cè)重于PPRSV感染后的早期診斷；豬藍(lán)耳病膜基質(zhì)蛋白M、糖蛋白GP5用于檢測(cè)感染或免疫抗體；豬瘟主要包被整個(gè)病毒或E2蛋白用于感染與免疫抗體檢測(cè)；常用豬偽狂犬病疫苗缺失gE基因，因此gE蛋白用于感染性抗體檢測(cè)，gB蛋白用于免疫抗體檢測(cè)；小反芻獸疫包被B抗原或N蛋白，用于感染與免疫抗體檢測(cè)（見表1）。

3 獸醫(yī)商品化ELISA試劑盒

表1 家畜疫病ELISA診斷方法

一般商品化的ELISA試劑盒組成主要有96孔平底包被板（coated plate）、樣品稀釋液（dilution buffer）、洗滌液（washing buffer）、酶標(biāo)記的結(jié)合物（conjugate）、顯色底物（substrate）、終止液（stop solution）、陽(yáng)性對(duì)照（positive control）、陰性對(duì)照（negative control）。有的試劑盒如蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫病毒液相阻斷ELISA試劑盒還有病毒抗原，青島立見小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒有吐溫-20等。

國(guó)內(nèi)各級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室采用商品化ELISA試劑盒進(jìn)行家畜疫病診斷，主要生產(chǎn)廠家有蘭州獸醫(yī)研究所、韓國(guó)金諾、美國(guó)IDEXX、西班牙海博萊、北京天之泰、青島立見等，不同試劑盒的檢測(cè)方法、顯色系統(tǒng)和讀數(shù)波長(zhǎng)不一致，挑選試劑盒時(shí)必須注意其方法與檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求、儀器設(shè)備濾光片是否匹配（見表2）。

表2 常用商品化ELISA試劑盒

4 操作步驟和影響因素

4.1 樣品前處理

抗體檢測(cè)需采集動(dòng)物血液分離血清，溶血的樣品因紅細(xì)胞釋放過氧化物酶活性物質(zhì)和血紅蛋白而影響檢測(cè)結(jié)果。標(biāo)本儲(chǔ)存時(shí)間過長(zhǎng)將形成多聚體進(jìn)而產(chǎn)生本底過深現(xiàn)象和假陽(yáng)性的出現(xiàn)。

4.2 試劑回溫

實(shí)驗(yàn)室溫度應(yīng)控制在18～25℃，從冰箱中取出ELISA試劑盒并打開，使試劑恢復(fù)至室溫，直至洗滌液結(jié)晶完全溶解。該步驟可減少ELISA板孔與孔之間的差異。

4.3 稀釋和加樣

某些試劑盒（如韓國(guó)金諾豬瘟抗體ELISA試劑盒）需要對(duì)樣品或?qū)φ者M(jìn)行稀釋，有的試劑盒（如蘭州所口蹄疫液相阻斷試劑盒）提供的陽(yáng)性血清已進(jìn)行過一定倍數(shù)稀釋，有的不需稀釋陽(yáng)性對(duì)照（如IDEXX PRRS X3試劑盒），有的試劑盒（如海博萊豬瘟競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒）不需要樣品稀釋直接加入ELISA板孔。豬藍(lán)耳病抗體ELISA試劑盒常常需要對(duì)樣品進(jìn)行40倍或200倍的稀釋，取樣量較小，必須準(zhǔn)確取樣。加樣時(shí)應(yīng)加至孔的底部，避免產(chǎn)生氣泡。

4.4 孵育

一般分室溫孵育（18～25℃）和溫箱孵育（37℃）兩種，溫箱孵育要特別注意封板的密閉性，防止溶液蒸發(fā)。ELISA板與板盡量不疊放，避免受熱不均。

4.5 洗滌

洗滌是為了清除非特異性干擾物質(zhì)，加入洗滌液的量一般300μL左右，以滿孔但不溢出為宜。每次洗滌均應(yīng)甩板和拍板，拍板輕重以無液體回流和無氣泡為準(zhǔn)。拍板后應(yīng)盡快加液，避免因放置時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致孔內(nèi)結(jié)合物失去生物活性。

4.6 加入酶標(biāo)結(jié)合物

按試劑盒說明稀釋或直接加入酶標(biāo)抗體（藍(lán)色或紅色）。

4.7 顯色和讀數(shù)

顯色時(shí)，需避光，否則TMB、ABTS等顯色液易失效。注意顯色液有一定致癌性，酸性終止液有腐蝕性。顯色后，應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)終止反應(yīng)并及時(shí)在酶標(biāo)儀上用規(guī)定波長(zhǎng)讀數(shù)。酶標(biāo)儀讀數(shù)OD值受讀數(shù)波長(zhǎng)、孔內(nèi)氣泡、孔壁液體、孔底液體斜度影響。

5 免疫抗體監(jiān)測(cè)結(jié)果判定

ELISA檢測(cè)結(jié)果常以陽(yáng)性（+）、陰性（-）、可疑（±）表示。根據(jù)2017年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃，免疫效果評(píng)估時(shí)，口蹄疫疫苗免疫后（豬28d，其他畜21d后）液相阻斷ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)≥26為免疫合格。高致病性豬藍(lán)耳病活疫苗免疫28d后ELISA檢測(cè)抗體陽(yáng)性判定為免疫合格。豬瘟疫苗免疫21d后抗體阻斷ELISA或間接ELISA檢測(cè)陽(yáng)性判定為免疫合格。小反芻獸疫活疫苗免疫1～3個(gè)月內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)ELISA或阻斷ELISA檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性即判定免疫合格。

6 存在問題及分析

6.1 陰陽(yáng)性對(duì)照不成立

原因可能有試劑盒批次間穩(wěn)定性差或不在有效期之內(nèi)、陰陽(yáng)性血清的保存時(shí)間過長(zhǎng)或凍融次數(shù)過多、操作過程中不同批次試劑混用等，可以通過使用不同試劑盒重復(fù)試驗(yàn)或者不同人員之間比對(duì)檢驗(yàn)來糾正。

6.2 相同來源的樣品在不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果不一致

原因可能有不同實(shí)驗(yàn)室的溫度、濕度、人員、儀器等條件不同，依據(jù)的ELISA檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)不同，樣品在分裝、保存時(shí)間和運(yùn)輸條件不同。解決的辦法是各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室考核辦法建立完整的質(zhì)量管理體系，對(duì)主要儀器設(shè)備進(jìn)行計(jì)量檢定，執(zhí)行現(xiàn)行有效的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，不定期的開展不同實(shí)驗(yàn)室之間的比對(duì)檢測(cè)。

6.3 不同廠家ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果有差異

原因是試劑盒使用的ELISA方法類型[7，8]、包被的抗原不同從根本上決定了結(jié)果的差異性?！?/p>

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