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    雞多種病原混合感染的研究

    2017-03-12 01:21:37劉華棟李婷婷陸冰洋王彩先唐娟丁樹榮詹麗娥
    中國動物保健 2017年11期
    關(guān)鍵詞:氣管炎新城疫瓊脂

    劉華棟,李婷婷,陸冰洋,王彩先,唐娟,丁樹榮,詹麗娥*

    (山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 山西太原 030032)

    2016年10月28日山西省太谷縣某養(yǎng)雞場85日齡的蛋雞發(fā)生疾病。此養(yǎng)雞場存欄雞10,000只,由于近期發(fā)生疾病,死亡數(shù)量劇增,每天死亡數(shù)量30~40只,且數(shù)量逐日增加。大群雞精神狀態(tài)差,采食量和飲水量均下降。場主攜帶5只發(fā)病雞來筆者研究室診斷,以下是詳細(xì)診斷內(nèi)容。

    1 臨床癥狀

    病雞喜臥,雙翅下垂,伸頸張口呼吸,眼睛緊閉,呈打盹狀,反應(yīng)遲鈍,拉黃綠色水樣稀便。

    2 病理變化

    剖檢可見喉頭水腫且有黃色干酪樣分泌物堵塞,幾乎接近完全堵死。氣管切開可見管腔有黃色膿性分泌物,沖洗去掉分泌物可見氣管壁出血,并有散在的潰瘍灶和壞死灶。心臟和肝臟有黃色纖維素樣分泌物沉淀包裹,肝臟腫大呈現(xiàn)土黃色。腺胃乳頭出血,腺胃和肌胃交界處出血。十二指腸呈現(xiàn)散在的棗核樣出血,空回腸也有散在的點(diǎn)狀出血。盲腸扁桃體出血嚴(yán)重,直腸出血。脾臟腫大。腎臟腫大出血,呈現(xiàn)花斑腎。

    3 實驗室檢查

    3.1 鑒別培養(yǎng)(普通培養(yǎng)和鑒別培養(yǎng))

    取病死雞的心、血液和肝臟樣品,無菌劃線接種于營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂和伊紅美藍(lán)瓊脂上,置37℃恒溫培養(yǎng)24h后,可見普通瓊脂上形成圓形、隆起、光滑、濕潤和灰白色中等大小的菌落,而麥康凱瓊脂上形成紅色菌落,伊紅美藍(lán)瓊脂上則形成黑色帶金屬光澤的菌落。

    3.2 病原鏡檢

    挑取單個菌落涂片,革蘭氏染色,鏡檢可見染成紅色的短小桿菌。

    3.3 生化鑒定

    將純培養(yǎng)的病原菌進(jìn)行生化鑒定,結(jié)果見表1。由表1結(jié)果可以判定分離菌為大腸桿菌。鹽產(chǎn)堿;NAGA:N-乙酰-β-葡萄糖氨酶;AGAL:α-半乳糖苷酶;PHOS:磷酸酶;GlyA:氨基乙酸芳胺酶;ODC:鳥氨酸脫羧酶;LDC:賴氨酸脫羧酶;IHISa:組氨酸同化;cMT:PE葡萄糖酸酶;BGUR:β-D-葡萄糖醛酸酶;O129R:O/129耐受;GGAA:谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶;lMLTa:L-蘋果酸鹽同化;ELLM:ELLMAN;lLATa:L- 乳酸鹽同化

    表1 分離菌的生化鑒定結(jié)果表

    3.4 藥敏實驗

    采用K-B試紙擴(kuò)散法[1],挑取大腸桿菌單個菌落均勻涂布于整個平板,將含有抗生素的藥敏紙片用燒灼滅菌的鑷子分別貼于平板表面,紙片之間間隔24mm以上,37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。測量藥敏紙片抑菌圈的直徑,參照CLSI手冊中的標(biāo)準(zhǔn)作出判斷[2],每次測定均以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株ATCC25922作參照。使用18種常規(guī)藥物對分離到的雞大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性實驗,結(jié)果見表2。

    由表2結(jié)果可見,分離菌對頭孢曲松、粘桿菌素中敏,對慶大霉素、安普霉素、鏈霉素和阿米卡星高敏,其他常用抗菌藥物均耐藥。

    3.5 傳染性喉氣管炎包涵體檢查

    無菌條件下取出病雞喉頭和氣管黏膜上皮,涂片,在無水甲醇中固定3~5min,姬姆薩氏染色2h,無水甲醇脫色,沖洗,干燥鏡檢[3,4],可見上皮細(xì)胞核內(nèi)有包涵體。結(jié)合臨床癥狀及剖檢病變確定其感染有傳染性喉氣管炎。

    3.6 瓊脂擴(kuò)散試驗

    采集病雞喉氣管分泌物與雞傳染性喉氣管炎高免血清做瓊脂擴(kuò)散試驗,置于37℃恒溫培養(yǎng)24h后觀察,結(jié)果被檢樣品與高免血清孔之間形成清晰的白色沉淀線。

    3.7 動物試驗

    取病死雞氣管分泌物,按1∶5加生理鹽水稀釋,用棉簽蘸取稀釋液涂擦喉頭和上腭,接種于40日齡易感雞5只,再用生理鹽水接種同日齡雞5只作對照[5]。1d后即有雞出現(xiàn)呼吸道癥狀,3d后全部出現(xiàn)雞傳染性喉氣管炎典型的呼吸道癥狀,流淚,結(jié)膜發(fā)炎。病理剖檢可見喉頭和氣管出血。對照組未見異常變化。

    3.8 ND的PCR鑒定

    從發(fā)病雞的肺臟、肝臟、脾臟等器官取樣1g,剪碎混勻后取0.05g研磨,8,000rpm離心后取上清,使用新城疫病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒檢測NDV,取已處理的樣品,加入裂解液600μL,充分顛倒混勻,室溫靜置3~5min。將液體吸入吸附柱中,13,000rpm離心30s。棄去收集管中的液體,加入600μL洗液,13,000rpm離心30s。重復(fù)上一步。棄去收集管中液體,13,000rpm空柱離心2min,以除去殘留的洗滌液。將吸附柱移入新的1.5mL離心管中,向柱中央加入洗脫液 50μL,室溫靜置1min,13000rpm離心30s,離心管中液體即為模板RNA。反轉(zhuǎn)錄條件為:42℃ 45min,94℃ 3min;PCR反應(yīng)條件為:94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 30s,共循環(huán)35次,72℃延伸7min。使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果,結(jié)果如圖1。

    表2 大腸桿菌藥敏實驗結(jié)果單位:mm

    由圖1結(jié)果可見,擴(kuò)增出明顯的條帶,與試劑盒里設(shè)定的擴(kuò)增片段大小相符。

    4 診斷

    圖1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

    根據(jù)臨床癥狀、病理變化和實驗室檢查,診斷為傳染性喉氣管炎、新城疫和大腸桿菌病混合感染。

    5 治療

    針對臨床分離到的病原和藥敏實驗結(jié)果,在飲水中添加阿米卡星治療大腸桿菌感染,肌肉注射新城疫Ⅰ系疫苗[6],使用傳染性喉氣管炎弱毒疫苗點(diǎn)眼[7],同時淘汰處理已發(fā)病的病雞。養(yǎng)殖場加強(qiáng)通風(fēng)、清掃和消毒工作。經(jīng)使用治療方案5天后,雞群整體精神恢復(fù)正常,無死亡。

    6 討論

    大腸桿菌為動物體內(nèi)的一類條件性致病菌[8],其發(fā)生與各種應(yīng)激因素有關(guān),在衛(wèi)生條件差、通風(fēng)不良、飼養(yǎng)管理不當(dāng)及動物免疫力下降的時候,容易誘發(fā)本病[9],在有其他病原感染后也易繼發(fā)感染。大腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性非常嚴(yán)重,山西地區(qū)雞源性大腸桿菌對青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素耐藥性均在50%以上,其中以青霉素類抗生素耐藥率最高[10]。這與本例大腸桿菌分離株藥敏試驗結(jié)果相符。表明在山西地區(qū)養(yǎng)殖場對藥物的使用有所偏好,使得這些藥物過量使用,警醒本地區(qū)養(yǎng)殖場在疾病治療過程中注意抗菌藥物的交替和輪換使用。

    雞傳染性喉氣管炎是皰疹病毒感染,只能靠疫苗來預(yù)防,弱毒苗目前是使用最多的一類疫苗[11]。本例雞場發(fā)病后使用弱毒疫苗點(diǎn)眼后未發(fā)生新的病例,說明疫苗起到保護(hù)作用,但弱毒疫苗作為傳統(tǒng)防治雞傳染性喉氣管炎病的疫苗出現(xiàn)過毒力過強(qiáng)和毒力返強(qiáng)問題[12,13],所以在使用雞傳染性喉氣管炎弱毒苗時要慎重。

    本例雞場此前接種過兩次新城疫疫苗,分別為Ⅰ系苗肌注和Ⅳ系苗飲水,此次仍然發(fā)病,說明接種疫苗并不能完全抵御疾病發(fā)生,疾病的發(fā)生還與感染ND病毒毒力強(qiáng)弱以及基因型有關(guān)系,但應(yīng)注意監(jiān)測及保持較高抗體水平,高抗體水平和整齊度對強(qiáng)毒感染有更高的抵抗力[14]?!?/p>

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