金花茶花絲愈傷組織培養(yǎng)及其對抗生素敏感性研究

于 波，朱 玉，袁 霖，黃麗麗，張佩霞，鄒春萍，孫映波

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境園藝研究所/農(nóng)業(yè)部華南都市農(nóng)業(yè)重點實驗室/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.中華生物資源應用協(xié)會，臺灣 宜蘭 26047；3.廣州市玉田山茶生物科技有限公司，廣東 廣州 510650）

金花茶〔Camellia chrysantha（hu）Tuyama〕，山茶科山茶屬金花茶組植物，花金黃色，為我國國寶級植物之一，被列為我國一級保護植物，主要分布于我國廣西和越南等地?！侗静菥V目》記載了金花茶藥用功能，現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)金花茶具有抑制腫瘤以及降血壓、膽固醇等功效［1］。目前，金花茶產(chǎn)業(yè)化開發(fā)方興未艾。金花茶組織培養(yǎng)研究始于20世紀80年代，在體細胞胚和愈傷組織誘導方面取得了很多重要研究進展，由子葉、幼胚及莖段培養(yǎng)獲得了體細胞和愈傷組織［2-10］。近年來，人們研究了光源或培養(yǎng)基成分對金花茶愈傷組織中DFR（二氫黃酮醇4-還原酶）、LAR（無色花色素還原酶）與PPO（多酚氧化酶）表達及總兒茶素含量的影響［10］；同時，還建立了金花茶組織培養(yǎng)和植株快繁體系［11-12］，但仍然有待優(yōu)化完善。目前，轉(zhuǎn)基因技術已經(jīng)成為主要糧食、油料、蔬菜和花卉作物的重要育種方法。山茶屬植物轉(zhuǎn)基因技術雖然已經(jīng)在茶樹（茶組植物）上獲得了突破［13-24］，但在包括金花茶在內(nèi)的茶花上還未見報道。在目前金花茶組培技術仍未完善成熟的情況下，利用金花茶愈傷組織進行轉(zhuǎn)基因的前期研究是一條可行的途徑。本研究利用金花茶幼嫩花蕾進行體外培養(yǎng)，建立了花絲愈傷組織培養(yǎng)體系，在此基礎上研究了卡那霉素和潮霉素對愈傷組織誘導和增殖培養(yǎng)的影響，為下一步開展金花茶轉(zhuǎn)基因研究提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試金花茶種植于廣東省農(nóng)科院環(huán)境園藝研究所山茶種質(zhì)資源圃。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體表面消毒 試驗于2015年1月開始進行，摘取剛剛金花茶露黃、但尚未開放的幼嫩花蕾，在超凈工作臺上用70%乙醇分別浸泡1、3、5、10、15 min，然后用滅菌水沖洗 3次，用刀片剝掉花瓣和萼片，取出雄蕊，將花絲和花藥分別接種到誘導培養(yǎng)基上，25（±1）℃，暗培養(yǎng)。誘導培養(yǎng)基成分為MS+TDZ（0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L）+2，4-D 1.0 mg/L，附加蔗糖 30 g/L、瓊脂 5.0 g/L，pH 5.8，121℃高溫高壓滅菌20 min，冷卻至60℃時在超凈工作臺上分裝至無菌培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中。8周后，觀察和統(tǒng)計不同消毒時間對金花茶花絲外植體污染和愈傷組織誘導等情況的影響，計算公式如下：

污染率（%）=（污染的外植體數(shù)÷接種的外植體總數(shù)）× 100

愈傷組織誘導率（%）=（誘導出愈傷組織的外植體數(shù)÷接種的未污染外植體總數(shù)）×100

1.2.2 愈傷組織增殖培養(yǎng) 用手術刀將金花茶花絲誘導獲得的愈傷組織切割破碎成直徑0.5 mm的組織塊，轉(zhuǎn)移至MS+TDZ 0.5 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L（pH 5.8）的培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為黑暗、25（±）1℃。培養(yǎng)基分裝在無菌培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，每皿分裝25 mL并放置5塊愈傷組織。培養(yǎng)4周后，觀察愈傷組織增殖情況。

1.2.3 愈傷組織誘導和增殖培養(yǎng)過程對抗生素敏感性測定 分別在愈傷組織誘導和增殖階段進行卡那霉素和潮霉素的敏感性試驗。在固體培養(yǎng)基MS+TDZ 0.5 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂 8.0 g/L（pH 5.8）中加入不同濃度梯度的抗生素，具體設置為：卡那霉素0（CK）、25、50、75、100、125、150 mg/L，潮霉素 0（CK）、5、10、15、20、25、30、35、40 mg/L。將花絲外植體和愈傷組織塊接種到各種培養(yǎng)基上。愈傷組織誘導階段的試驗培養(yǎng)8周，記錄和統(tǒng)計各個試驗處理的外植體存活率和愈傷組織誘導率。愈傷組織增殖階段試驗培養(yǎng)4周，記錄和統(tǒng)計各個試驗處理的愈傷組織增殖率，計算外植體存活率和愈傷組織增殖率：

外植體存活率（%）=（存活的外植體數(shù)÷接種的外植體總數(shù)）× 100

愈傷組織增殖率（%）=（形成新愈傷組織數(shù)÷接種的愈傷組織總數(shù)）× 100

上述試驗每個處理3次重復，每個重復50個外植體或愈傷組織塊。

試驗數(shù)據(jù)方差分析使用SAS V8.0軟件，差異顯著性測驗采用鄧肯氏（1955）多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 金花茶外植體表面消毒和愈傷組織誘導培養(yǎng)

將花絲和花藥外植體分別接種至愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)8周后，統(tǒng)計花絲外植體在各個消毒處理中污染情況。結(jié)果表明，70%乙醇浸泡消毒1 min，外植體污染率最高、達58.7（±6.1）%；浸泡3 min時，污染率仍達35.3（±4.2）%；隨著70%乙醇浸泡時間的延長，污染率逐漸下降，當乙醇浸泡5 min時，污染率下降至14.0（±4.0）%；乙醇浸泡10 min和15 min時，污染率均為0。各處理間差異顯著。

兩種外植體暗培養(yǎng)8周過程中，花藥外植體表面全部褐化，沒有形成愈傷組織（圖1A，封二）。部分花絲外植體兩端傷口部位膨大形成突起，逐漸形成愈傷組織（圖1B，封二），這些愈傷組織呈乳白色至淺黃色、半透明狀。不同TDZ和2，4-D組合培養(yǎng)基上花絲誘導愈傷組織觀察結(jié)果表明，當培養(yǎng)基中2，4-D濃度固定在1.0 mg/L時，愈傷組織誘導率隨著TDZ濃度的變化而不同：當TDZ濃度為0.25 mg/L時，愈傷組織誘導率為72.7（±3.1）%；當TDZ濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織誘導率最高達100%；隨著TDZ濃度的提高，愈傷組織誘導率逐漸下降，TDZ濃度為1.0 mg/L時誘導率為86.7（±4.2）%，TDZ濃度為2.0 mg/L時誘導率為62.0（±3.5）%。各處理間差異顯著。

2.2 金花茶愈傷組織增殖培養(yǎng)

將誘導獲得的愈傷組織切割破碎成直徑0.5 mm的組織塊，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，黑暗條件下培養(yǎng)4周后，所有愈傷組織塊均明顯增殖。連續(xù)多次繼代培養(yǎng)后，愈傷組織顏色形態(tài)與初代愈傷組織保持基本相同，呈現(xiàn)乳黃色半透明狀（圖2，封二）。

2.3 金花茶愈傷組織誘導對卡那霉素和潮霉素的敏感性

卡那霉素和潮霉素對金花茶愈傷組織誘導階段的影響如圖3、圖4所示。在不添加任何抗生素的對照組，金花茶外植體存活率和愈傷組織誘導率均達100%。添加卡那霉素或潮霉素對金花茶外植體存活和愈傷組織誘導均有不同程度的影響，并且隨著抗生素濃度的提高其影響也越大。當卡那霉素濃度為25 mg/L或潮霉素濃度為5 mg/L時，外植體存活率分別為64.0%和79.3%，愈傷組織誘導率分別為55.3%和66.0%，隨著兩種抗生素濃度的提高，金花茶外植體存活率和愈傷組織誘導率明顯下降，當卡那霉素濃度達75 mg/L或潮霉素濃度達20 mg/L時，花絲外植體上不再形成愈傷組織，卡那霉素100 mg/L或潮霉素30 mg/L條件下花絲外植體全部死亡。

圖3 卡那霉素和潮霉素對金花茶外植體存活率的影響

圖4 卡那霉素和潮霉素對金花茶愈傷組織誘導率的影響

2.4 金花茶愈傷組織增殖培養(yǎng)對卡那霉素和潮霉素的敏感性

從圖5可以看出，在不添加任何抗生素的對照組，金花茶愈傷組織增殖率均達100%。當卡那霉素濃度為25 mg/L或潮霉素濃度為5 mg/L時，愈傷組織的增殖率分別為60.7%和68.7%。隨著兩種抗生素濃度的提高，愈傷組織增殖率明顯下降。當卡那霉素濃度為100 mg/L或潮霉素濃度為25 mg/L時，金花茶愈傷組織的增殖被完全抑制，最終全部褐化死亡。

圖5 卡那霉素和潮霉素對金花茶愈傷組織增殖率的影響

3 結(jié)論與討論

目前，在山茶屬植物愈傷組織誘導研究中多數(shù)采用葉片、莖段和莖尖等［25-28］，本研究采用幼嫩花蕾中的花絲為外植體，高頻率的誘導獲得了愈傷組織。包括茶花在內(nèi)的山茶屬植物組織培養(yǎng)以往通常采用酒精和升汞配合使用進行外植體表面消毒［25-28］，步驟較繁瑣，本研究采用金花茶剛剛露黃的幼嫩花蕾進行組培研究，取得較好的效果。由于此時花序尚未打開，花蕾由花瓣和萼片緊緊包裹，故表面消毒劑只采用70%乙醇。結(jié)果表明，70%乙醇浸泡10 min即可達到理想的消毒效果。本研究不僅簡化了表面消毒操作步驟，還避免了使用氯化汞等劇毒試劑可能帶來的風險。

山茶屬轉(zhuǎn)基因研究報道主要集中于茶樹（茶組植物）［14-25］，茶花上還未見轉(zhuǎn)基因成功的報道。已有報道中，轉(zhuǎn)基因的選擇劑多數(shù)采用卡那霉素或超霉素。在轉(zhuǎn)基因篩選階段，卡那霉素濃度一般在30～200 mg/L，潮霉素濃度一般在10～75 mg/L。本研究在金花茶花絲愈傷組織誘導階段，卡那霉素100 mg/L或潮霉素30 mg/L導致花絲外植體全部褐化死亡；卡那霉素75 mg/L或潮霉素20 mg/L能夠抑制愈傷組織從花絲外植體上產(chǎn)生。在愈傷組織增殖階段，卡那霉素100 mg/L或潮霉素25 mg/L則能夠完全抑制愈傷組織的增殖，并導致最終褐化死亡。金花茶的花絲外植體或愈傷組織對兩種抗生素均表現(xiàn)出一定敏感性，且無論是愈傷組織誘導階段還是增殖階段，金花茶對潮霉素均更加敏感，因此，今后金花茶轉(zhuǎn)基因研究中使用潮霉素時要嚴格掌握工作濃度。

綜上所述，本研究利用金花茶幼嫩花絲成功建立了愈傷組織誘導和增殖培養(yǎng)體系，在此基礎上，研究了不同培養(yǎng)階段金花茶對卡那霉素和潮霉素的敏感性，為下一步開展金花茶轉(zhuǎn)基因研究提供重要技術參考。

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