急、慢性乙型肝炎患者漿細胞樣樹突狀細胞與輔助性CD4+T細胞的功能研究

曹衛(wèi)華 冉崇平 齊天林 王星月 屈曉晶 張丹 張璐 路遙 吳淑玲 郝紅曉 常敏 胡蕾蘋 劉如玉 吳云忠 楊民 華文浩 劉順愛 李明慧 謝堯

100015 北京大學地壇醫(yī)院教學醫(yī)院肝病中心(曹衛(wèi)華、謝堯)；100015 首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院肝病中心(冉崇平、齊天林、王星月、屈曉晶、張丹、張璐、路遙、吳淑玲、郝紅曉、常敏、胡蕾蘋、劉如玉、吳云忠、楊民、李明慧)；檢驗科(華文浩)；傳染病研究所(劉順愛)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)屬于嗜肝DNA病毒，乙型肝炎病毒感染是宿主免疫、肝細胞和病毒之間相互作用的動態(tài)過程。成人感染HBV后多數(shù)表現(xiàn)為急性、自限性(>95%)，但新生兒感染后多數(shù)進展為慢性感染(>90%)[1-2]。在HBV感染中，pDCs是固有免疫應答早期抗病毒的主要效應細胞，是連接固有免疫和適應性免疫的橋梁。pDCs識別病毒核酸產(chǎn)生大量的I型干擾素，其不僅有強大的抗病毒作用，而且還可以激活NK細胞介導的細胞毒作用以及CD4+T細胞、CD8+T細胞的分化及存活[3-5]。輔助性CD4+T細胞在適應性免疫應答中發(fā)揮重要的免疫學效應。在慢性HBV感染中免疫細胞功能受損，而在急性HBV感染中，體內(nèi)HBV的CD4+T細胞的應答是多克隆的、多特異性的強烈的細胞免疫應答，病毒最終被清除，而在慢性HBV感染中，HBV的特異性細胞免疫反應較弱[6-8]。該研究通過探討急、慢性HBV感染患者外周血pDC及其表面功能分子的變化以及CD4+T細胞頻數(shù)，Th1、Th2亞群差異，并分析了它們與HBV DNA、HBV markers、ALT的相關性，從而有助于了解pDC、輔助性CD4+T細胞在急、慢性HBV感染中的作用。

1 材料與方法

1.1患者該研究入組自2014年10月至2017年5月到首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院就診的123例患者, 包括急性乙型肝炎和慢性乙型性肝炎免疫活動期患者兩組，這些患者均為初治患者。其中有11例急乙肝患者在6個月隨訪中失訪。肝炎診斷標準參照文獻[9-10]。急性乙型肝炎組診斷標準：有證據(jù)證明6個月前無HBV感染，入組時HBsAg陽性，HBeAg和HBV DNA陽性或陰性，ALT異常，Anti-HBcIgM大于10 S/CO或經(jīng)肝臟組織病理學檢查診斷為急性乙型肝炎。慢乙肝免疫活動期(IA)：HBsAg陽性6個月以上，HBV DNA(+)，HBeAg≥100 S/CO，ALT≥150 U/L，且至少有3個月以上的ALT異常史，或肝組織病理學檢查顯示有明顯炎癥壞死。排除標準：梅毒、艾滋抗體陽性者，合并HCV, HDV 等其它病毒感染者，伴有其它肝臟疾病者(脂肪肝，自身免疫性肝病，酒精性肝病，肝臟代謝性疾病，肝纖維化，肝硬化以及肝癌)。該研究已通過首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院倫理委員會審核；每位患者均已獲得知情同意。入組患者特征如表1所示。

1.2細胞表型染色及流式細胞儀分析用Lineage1-FITC, HLA-DR-PerCP, CD123-APC和CD86-PE四種抗體檢測pDC、CD86+pDC，并用FlowJo7.6計算CD86MFI；另外，CD3-PerCP、CD4-FITC、CD45RO-APC和CD62 L-PE四種抗體用于Th1、Th2染色分群：CD3+CD4+CD45RO+CD62 L-為Th1型細胞、CD3+CD4+CD45RO+CD62 L-為Th2型細胞。

1.3臨床指標(ALT、HBeAg、HBsAg和HBVDNA)檢測患者每3～6個月檢測病毒學指標及生化指標，血常規(guī)等，這些指標均由首都醫(yī)科大學附屬北京地壇醫(yī)院檢驗科提供，采用日立全自動生化分析儀檢測肝功能；HBsAg、HBeAg采用Abbott微粒化學發(fā)光試劑檢測；采用實時熒光PCR(試劑購自上海復興公司)或羅氏CobasAmpliPrep/CobasTaqMan96全自動實時熒光定量PCR檢測試劑檢測血清HBV DNA含量。

表2 IA、AHB、AHB-R組間pDC、CD86+pDC、CD4+T細胞頻數(shù)、亞型及功能分子

注：AHB，急性乙型肝炎組; IA，免疫活動期；AHB-R，急性乙型肝炎恢復期；P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義

Notes： AHB，acute hepatitis B; IA, immune activity; AHB-R: acute hepatitis B recovery period;P<0.05 was considered to be statistically significant

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean ± SEM)或中位數(shù)、四分位數(shù)間距[median(Q1,Q3)]或box-and-whisker plots呈現(xiàn),利用GraphPad Prism 5分析。組內(nèi)比較用Wilcoxon檢驗，多組間兩兩比較用Mann-Whitney U 檢驗。變量的相關性分析采用線性回歸分析。P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1IA和AHB兩組間基線HBVDNA含量、血清HBsAg、HBeAg水平及ALT水平的比較IA組和AHB組間HBV DNA含量、HBsAg水平、HBeAg水平和ALT水平均具有顯著性差異(P<0.001)，IA組HBV DNA含量、HBsAg水平、HBeAg水平顯著高于AHB組，而ALT水平顯著低于AHB組(表1)。

表1 入組患者基本特征

注：AHB，急性乙型肝炎組; IA，免疫活動期;P<0.05 差異有統(tǒng)計學意義

Note：AHB, acute hepatitis B；IA, immune activity；P<0.05 was considered to be statistically significant

2.2在IA和AHB組，pDC頻數(shù)、CD86+pDC頻數(shù)以及功能分子表達,CD4+T細胞頻數(shù),Th1、Th2亞群細胞頻數(shù)及Th2/Th1比值表2結果顯示：IA組與AHB組相比，pDC頻數(shù)兩組間差異無統(tǒng)計學意義，CD86+pDC頻數(shù)和CD86MFI水平顯著高于AHB組; AHB組CD4+T頻數(shù)顯著高于IA組，而Th2頻數(shù)、Th1頻數(shù)、Th2/Th1在兩組間差異無統(tǒng)計學意義。AHB組和AHB-R組相比，AHB-R組CD86+pDC頻數(shù)顯著高于AHB組；CD4+T頻數(shù)、Th1頻數(shù)兩組間雖無統(tǒng)計學差異，但是AHB組CD4+T頻數(shù)中位數(shù)值高于AHB-R組，而AHB組Th1頻數(shù)中位數(shù)值低于AHB-R組。

圖1 20例急性乙型肝炎恢復患者外周血CD4+T細胞、Th1、Th2亞群細胞所占的頻數(shù)及Th2/Th1比值的變化趨勢Fig.1 The changed trend of frequency of CD4+T cells, Th1, Th2 subset and ratio of Th2/Th1 in peripheral blood in the recovery of 20 patients with acute hepatitis B

項目ItemAHB?IAHB?RP入組數(shù)(N)Casenumber(N)2020pDC/PBMC(%)median(Q1，Q3)0 20(0 14，0 27)0 21(0 13，0 29)0 743CD86+pDC(%)median(Q1，Q3)18 00(13 13，20 95)22 50(18 48，27 95)0 025CD86MFImedian(Q1，Q3)57 25(49 50，73 43)59 60(47 20，74 40)0 955CD4+T(%)median(Q1，Q3)41 15(35 78，44 63)34 95(26 00，43 65)0 104Th2(%)median(Q1，Q3)40 75(32 33，46 80)37 95(29 80，46 08)0 709Th1(%)median(Q1，Q3)21 25(17 68，32 23)23 60(19 75，28 28)0 940Th2/Th1median(Q1，Q3)1 85(1 29，2 12)1 59(1 16，2 09)0 709

注：AHB-I，急性乙型肝炎炎癥期；AHB-R，急性乙型肝炎恢復期；P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義

Notes： AHB-I，acute hepatitis B inflammation period; AHB-R，acute hepatitis B recovery period;P<0.05 was considered to be statistically significant

2.320例急乙肝恢復患者pDC頻數(shù)、CD86+pDC頻數(shù)以及功能分子表達,CD4+T細胞頻數(shù),Th1、Th2亞群細胞頻數(shù)及Th2/Th1比值在入組的31例急乙肝患者中20例在24周時恢復，急乙肝恢復期CD86+pDC頻數(shù)顯著高于急性炎癥期CD86+pDC頻數(shù)(表3)，而pDC頻數(shù)和CD86MFI在急乙肝恢復前后差異無統(tǒng)計學意義(表3)。然而，對于輔助性CD4+T細胞在急乙肝恢復前后雖然沒有統(tǒng)計學差異(表3)，但是由圖1中可以看出在急乙肝恢復前后CD4+T、Th2、Th1頻數(shù)及 Th2/Th1比值存在變化趨勢：CD4+T、Th2頻數(shù)在急乙肝恢復后有下降趨勢(圖1 A,1B)，而Th1頻數(shù)則呈上升趨勢(圖1C)，Th2/Th1比值降低(圖1D)。

2.4臨床指標(ALT、HBeAg、HBsAg和HBVDNA)與pDC、輔助性T細胞及功能分子的相關性

在AHB組，HBV DNA與ALT(r=0.450,P=0.006)、Th2頻數(shù)(r=0.304,P=0.048)呈正相關；而在IA組HBV DNA、HBsAg、HBeAg與ALT、pDC頻數(shù)、CD86+pDC頻數(shù)、CD86MFI、CD4+T細胞頻數(shù)、Th2頻數(shù)、Th1頻數(shù)及Th2/Th1均無相關性。

3 討論

pDCs 通過TLR9 識別病毒，依賴MyDD88 信號途徑，激活IRF7 和NF-κB，從而分泌大量I 型IFN及多種炎性細胞因子，如TNF-α、IL-12 和IL-6。I 型IFN 不僅能直接抑制病毒復制，而且能增強NK 細胞介導的細胞毒和IFN-γ生成，輔助性CD4+Th 細胞的分化，CD8+T 細胞細胞毒活性和IFN-γ的分泌[4-5]。

不同的HBV感染狀態(tài)，有著不同的免疫應答結果和臨床轉歸；HBV感染中，pDCs在固有免疫應答早期抗病毒中發(fā)揮重要作用， CD4+T細胞在適應性免疫應答中對清除病毒感染起關鍵作用。本研究結果顯示，慢性感染者中具有刺激作用的CD86+pDC頻數(shù)及功能分子CD86表達顯著高于急性感染者，而CD4+T細胞頻數(shù)顯著低于急性感染者，也就是說，在慢性HBV感染早期，固有免疫中的pDC細胞發(fā)揮主導作用，適應性免疫的CD4+T細胞免疫應答減弱，而急性HBV感染早期，非特異性免疫應答較弱，隨著感染進展，病毒復制增加，體內(nèi)迅速誘發(fā)針對HBV感染的強烈的特異性細胞免疫應答，輔助性CD4+T細胞免疫增強[7,11]，在清除病毒中起主導作用。

急性HBV感染者大多數(shù)可發(fā)生自限性恢復。本研究顯示，急性乙型肝炎恢復后具有刺激功能的CD86+pDC頻數(shù)顯著增加；先前研究表明，病毒及其蛋白抑制pDC功能[12-13]，感染恢復后，病毒及其蛋白顯著下降，對pDC功能的抑制作用減弱，使得具有刺激功能的CD86+pDC頻數(shù)增加，pDC功能有所恢復。本研究還發(fā)現(xiàn)，CD4+T、Th2頻數(shù)在急乙肝恢復后呈現(xiàn)下降趨勢，而Th1頻數(shù)則呈現(xiàn)上升趨勢，Th2/Th1比值降低，在急性乙型肝炎感染期，Th2型細胞占主導作用，而在感染恢復期，Th1型細胞占主導地位。急性HBV感染恢復過程中，隨著ALT水平的增加，為了避免免疫應答對肝臟的過度損傷，機體內(nèi)的負反饋調(diào)節(jié)機制致使特異性的細胞免疫應答CD4+T細胞免疫被抑制[14]，因此CD4+T頻數(shù)有下降趨勢。Th2型細胞主要通過調(diào)節(jié)體液免疫，并分泌促炎癥細胞因子，參與肝臟的炎癥損傷過程[15-16]，急性感染恢復后，Th2型細胞頻數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，炎癥損傷受到抑制；有研究顯示，Th1型細胞主要通過釋放多種細胞因子如IL-2、IFN-γ，調(diào)節(jié)CTL細胞的細胞毒作用，介導細胞免疫應答，有利于自身病毒的清除[17]，在急性感染恢復期，Th1型細胞頻數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢，在恢復期發(fā)揮主導作用，促進病毒感染的徹底清除。

有研究證實，急性乙型肝炎感染期，隨著病毒快速復制，激發(fā)CD4+T細胞和CD8+T細胞的細胞免疫應答作用，誘發(fā)明顯的肝臟炎癥損傷，致使大量病毒感染肝細胞受損，釋放出大量的ALT[18]，研究結果：在AHB組，HBV DNA與ALT、Th2頻數(shù)呈正相關也證實了這一觀點。

總之，pDC、輔助性CD4+T細胞頻數(shù)及功能的變化在HBV感染的不同狀態(tài)及臨床轉歸中發(fā)揮重要的作用，深入了解pDC、輔助性CD4+T細胞在急慢性HBV感染中的作用有助于為治療HBV感染提供新策略。

[1] Chu CM, Liaw YF. Natural History of Hepatitis B Virus Infection[M]//Hepatitis B Virus in Human Diseases. Springer International Publishing, 2016: 217-247. doi:10.1007/s00430-014-0369-7.

[2] Trépo C, Chan H L Y, Lok A. Hepatitis B virus infection[J]. Lancet, 2014, 384(9959): 2053-2063.doi:10.1016/S0140-6736(14)60220-8.

[3] Swiecki M, Wang Y, Vermi W, et al. Type I interferon negatively controls plasmacytoid dendritic cell numbers in vivo[J]. J Exp Med, 2011, 208(12): 2367-2374. doi: 10.1084/jem.20110654.

[4] Sun H, Zhou D, Zhou J. The role of DCs in the immunopathogenesis of chronic HBV infection and the methods of inducing DCs maturation[J]. J Med Virol, 2016, 88(1): 13-20. doi: 10.1002/jmv.24306.

[5] 屈曉晶, 張璐, 李明慧, 等. 固有免疫在 HBV 感染發(fā)病和治療中的作用[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2017,31(1): 83-88. doi：10．3760/cma．j．issn．1003—9279．2017．01．018.

[6] Ferrari C. HBV and the immune response[J]. Liver Int , 2015, 35(s1): 121-128. doi: 10.1111/liv.12749.

[7] Bauer T, Sprinzl M, Protzer U. Immune control of hepatitis B virus[J]. Dig Dis, 2011. 29(4): 423-433. doi:10.1159/000329809.

[8] 張丹, 李明慧, 屈曉晶, 等. HBV 不同感染狀態(tài)患者 CD4+T 細胞功能的差異研究[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志, 2016,30(2): 185-188. doi：10．3760/cma．j．issn．1003-9279．2016．02．019.

[9] 中華醫(yī)學會肝病學分會, 中華醫(yī)學會感染病學分會. 慢性乙型肝炎防治指南 (2010 年版)[J]. 中國醫(yī)學前沿雜志 (電子版), 2011, 3(1): 66-82. doi： 10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2011.01.007.

[10] European Association For The Study Of The Liver. EASL clinical practice guidelines: Management of chronic hepatitis B virus infection[J]. J Hepatol, 2012, 57(1): 167-185. doi:10.1016/j.jhep.2012.02.010.

[11] Fisicaro P, Valdatta C, Massari M, et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B[J]. Gastroenterology, 2010, 138(2): 682-693.doi: 10.1053/j.gastro.2009.09.052.

[12] Lan S, Wang X, Wu L, et al. Hepatitis B virus e antigen (HBeAg) may have a negative effect on dendrtic cells maturation[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2016, 9(2): 742-749. doi:www.ijcep.com /ISSN:1936-2625/IJCEP0018918.

[13] Woltman AM, Den Brouw MLO, Biesta PJ, et al. Hepatitis B virus lacks immune activating capacity, but actively inhibits plasmacytoid dendritic cell function[J]. PLoS One, 2011, 6(1): e15324. doi:10.1371/journal.pone.0015324.

[14] Bertoletti A, Ferrari C. Innate and adaptive immune responses in chronic hepatitis B virus infections: towards restoration of immune control of viral infection[J]. Gut, 2012, 61(12): 1754-1764. doi:10.1136/gutjnl-2011- 301073.

[15] Jung MC, Pape GR. Immunology of hepatitis B infection[J]. Lancet Infect Dis, 2002, 2(1): 43-50. doi:10.1016/S1473-3099(01)00172-4.

[16] Li MH, Zhang D, Zhang L, et al. Ratios of T-helper 2 Cells to T-helper 1 Cells and Cytokine Levels in Patients with Hepatitis B[J]. Chin Med J, 2017, 130(15): 1810. doi:10.4103/0366-6999.211541.

[17] Han YP, Li J, Jiang LF, et al. Hepatitis B e antigen from chronic hepatitis B patients induces Th1/Th2 cytokine imbalance in vitro[J]. Chin J Hepatol, 2013, 21(8): 584-589. doi: 10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2013. 08.006.

[18] Li X, Wang Y, Chen Y. Cellular immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection[J]. Microb Pathogenes, 2014, 74: 59-62. doi:10.1016/j.micpath.2014.07.010.