超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測孕產(chǎn)婦血清中18種抗生素

潘志峰 馬文娟 顏崇淮 梁俊

（1.上海溯源生物技術(shù)有限公司，上海 201210；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433；3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092）

抗生素的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用在人和動物疾病的預(yù)防與治療、畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為添加劑加快動物生長和促進(jìn)增產(chǎn)方面都起到了極其重要的作用［1］，從而導(dǎo)致抗生素在全球范圍內(nèi)的大量使用，濫用的現(xiàn)象十分普遍［2-6］。環(huán)境污染物中抗生素的殘留和動植物食品中食源性抗生素的存在導(dǎo)致人體可能通過食源性渠道持續(xù)性攝入抗生素，導(dǎo)致抗生素的低劑量持續(xù)性暴露。由于醫(yī)用抗生素使用實(shí)質(zhì)上是短期高劑量暴露，而來自食品或環(huán)境中的抗生素是低劑量持續(xù)暴露，近階段研究結(jié)果提示抗生素的暴露模式可能是影響其促進(jìn)脂肪生成的重要因素之一［7］；Martin Blaser團(tuán)隊(duì)動物研究表明，食源性抗生素對生命早期可能會產(chǎn)生有害的長期影響，即使是在低濃度水平下也會影響嬰幼兒腸道菌群平衡，并在嬰幼兒后續(xù)的發(fā)育過程中影響其免疫系統(tǒng)的發(fā)育以及營養(yǎng)代謝（導(dǎo)致肥胖）［8，9］，John Bieneistock團(tuán)隊(duì)研究揭示了諸如青霉素這樣的窄譜抗菌素對于腸道微生物及其行為的影響，甚至?xí)π袨楹湍X神經(jīng)化學(xué)造成長期影響［10］。結(jié)合中國現(xiàn)狀，來自畜牧養(yǎng)殖業(yè)、實(shí)驗(yàn)小鼠、兒童流行病學(xué)的證據(jù)一致表明：食源性污染物中抗生素的低劑量持續(xù)性暴露能改變生命體早腸道菌群分布，干預(yù)生命體早期發(fā)育。因此對于孕產(chǎn)婦和嬰幼兒來說，監(jiān)測孕產(chǎn)婦體內(nèi)食源性抗生素暴露水平，預(yù)防和避免新生兒過早的接觸抗生素顯得尤為重要！

自1943年青霉素應(yīng)用于臨床，抗生素發(fā)展迅猛，比較常見的抗生素種類有β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、酰胺醇類、氨基糖苷類、四環(huán)素類等，加上對革蘭菌（G＋／G-）有作用的其他抗生素，現(xiàn)有抗生素已達(dá)幾千種。臨床上血藥濃度監(jiān)測大多是針對單一化合物或某一族類（如青霉素類、磺胺類）的化合物進(jìn)行研究［11，12］，監(jiān)測的藥物濃度水平較高，而食源性抗生素暴露水平遠(yuǎn)低于血藥濃度監(jiān)測水平，并且種類繁雜，包含了幾乎所有醫(yī)用和獸用抗生素。目前還沒有血清中多類別多種抗生素的同時檢測的文獻(xiàn)報(bào)道，為監(jiān)測普通人群的抗生素暴露水平，需要建立一種更加靈敏穩(wěn)定的檢測方法。鑒于此，為了更有效地檢測食源性抗生素在母嬰體內(nèi)的暴露水平，避免和干預(yù)抗生素暴露對于生命體早期生長發(fā)育的影響，本研究采用固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（SPE-LC-MS／MS）技術(shù)建立了血清中6類18種抗生素的同時定量分析方法，包括β-內(nèi)酰胺類（β-lactams）、喹諾酮類（4-quinolones）、磺胺類（sulfonamides）、四環(huán)素類（Tetracyclines）、氯霉素類（chloramphenicol）和林可霉素（Lincomycin），可在8分鐘內(nèi)完成全部目標(biāo)抗生素分析。

1 材料和方法

標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine）、磺胺吡啶（Sulfapyridine）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine）、磺胺噻唑（Sulfathiazole）、青霉素（Penicillin）、阿莫西林（Amoxicilin）、氨 芐 西 林 （Ampicillin）、苯 唑 西 林（Oxacillin）、頭孢噻吩（Cephalothin）、頭孢噻肟（Cefotaxime）、左氧氟沙星（Levolfoxacin）、諾氟沙星（Norfloxacin）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）、四環(huán)素（Tetracycline）、土霉素（Oxytetracycline）、金霉素（Chlortetracycline）、氯霉素（Chloramphenicol）和林可霉素（Lincomicin）均購自中國藥品生物制品檢定所。

乙腈（質(zhì)譜級）、甲醇（質(zhì)譜級）、甲酸（色譜級）和磷酸（色譜級）均購自賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 樣本處理方法 取140μl血清樣本，加入140μl的4%磷酸溶液，旋渦混勻1分鐘，取混合液200μl加入到Oasis HLBμElution Plate小孔中進(jìn)行固相萃取。上樣前，SPE小孔依次用200μl甲醇和200μl水（水2次共400μl）活化平衡；上樣后用抽濾裝置抽干小孔并用100μl水沖洗2次后抽干。樣本孔用50μl 60%乙腈洗脫并抽濾兩次至抽干；用96孔收集板收集2次洗脫液上機(jī)待測。

1.3 液相色譜方法 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（1.8μm，2.1 mm×100 mm，美國 Waters公司）；柱溫40℃，進(jìn)樣量5μl，樣品室溫度10℃。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為甲醇，流速0.4 ml／min，梯度洗脫程序見表1。

1.4 質(zhì)譜方法 電噴霧離子源正負(fù)離子（ESI＋／ESI-）切換模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式采集分析，毛細(xì)管電壓分別為3.0k V＋／2.5k V-，離子源溫度為150℃，脫溶劑氣溫度為550℃，脫溶劑氣流速為1000l／h，錐孔氣流速為50ml／h。每種抗生素的詳細(xì)質(zhì)譜檢測參數(shù)見表2。

表1 18種抗生素梯度洗脫程序

2 結(jié)果

2.1 色譜條件的優(yōu)化 分別考察了Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)的 BEH C18（1.7μm，2.1mm×50mm）和 HSS T3（1.8μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱，結(jié)果顯示T3色譜柱極性跨度大，對于阿莫西林等極性較大的化合物T3色譜柱的保留效果更佳。流動相的選擇結(jié)果表明甲醇做溶劑時，抗生素能夠完全分離且甲醇能夠改善峰形，因此流動相選擇甲醇。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 六大類抗生素的質(zhì)譜行為不同，氯霉素在負(fù)離子模式（ESI－）下有較強(qiáng)信號，在正離子模式（ESI＋）下信號非常弱，而其他種類抗生素正好相反。因此本方法中選擇正、負(fù)離子模式同時監(jiān)測，一次性對所有目標(biāo)抗生素進(jìn)行分析，減少了分析用時。2.3 樣本前處理方法的優(yōu)化 比較了傳統(tǒng)的乙腈沉淀蛋白離心后氮吹復(fù)溶的方法與Oasis HLB固相萃取法，結(jié)果顯示Qasis HLB SPE的凈化效果與回收率都要好于蛋白沉淀氮吹法，且不易造成交叉污染。

洗脫液的考察，由于甲醇容易將磷脂等洗脫下來，因此選擇以不同濃度梯度（100%、80%、60%）的乙腈水溶液進(jìn)行洗脫，結(jié)果顯示乙腈溶液的有機(jī)相比例過高會產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，60%乙腈的效果最佳，既保證了抗生素有較高的回收率，又能去除溶劑效應(yīng)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證 方法學(xué)驗(yàn)證參考《化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》2014年第4號通告進(jìn)行評估。

2.4.1 特異性 考察6個不同個體的空白生物樣品色譜圖（圖1），以及空白生物樣品外加對照物質(zhì)色譜圖（圖2）。結(jié)果表明空白血液的基質(zhì)構(gòu)成不干擾目標(biāo)抗生素的測定。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量范圍 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置，將抗生素標(biāo)準(zhǔn)品分別用水或甲醇溶解成1mg／ml的溶液，然后配置成相應(yīng)質(zhì)量濃度的混標(biāo)，然后在空白血清中分別以不同質(zhì)量濃度梯度做添加，配成含全部18種抗生素系列的血清樣品。由于儀器對于每一種抗生素化合物的信號響應(yīng)值不同，各種抗生素的檢測靈敏度不同和參考相關(guān)化合物FDA限量標(biāo)準(zhǔn)為其他方法提供佐證等原因，各種抗生素的配置濃度有異同。表3為方法經(jīng)最終優(yōu)化后的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度和定量范圍，標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的實(shí)測值與標(biāo)示值之間的偏差在可接受的范圍之內(nèi)，最低濃度點(diǎn)的偏差在±20%以內(nèi)，其余濃度點(diǎn)的偏差在±15%以內(nèi)。

表3 18種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度和定量范圍

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度 連續(xù)3天選取分析批次，選定標(biāo)準(zhǔn)曲線的STD2、STD4、和STD6添加到空白血清作為高、中、低3個濃度的質(zhì)控樣品，各做5次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)回收率范圍與偏差度見表4。

表4 18中目標(biāo)抗生素的回收率范圍統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論與探討

本研究參考環(huán)境、食品安全、藥代動力學(xué)研究等現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法，并結(jié)合血液樣本采樣量少不利于不同種類抗生素多次檢測的實(shí)際情況，對于血清樣本的前處理和液相色譜、質(zhì)譜條件等進(jìn)行了優(yōu)化，建立了血清中六大類共18種抗生素的UPLC-MS／MS分析方法，按照《化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行方法學(xué)確證，結(jié)果表明該方法對于18種目標(biāo)抗生素的檢測具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的藥代動力學(xué)研究方法相比，本研究的創(chuàng)新性在于對人體內(nèi)亞臨床劑量或更低濃度多種抗生素的同時檢測，絕大部分化合物靈敏度提高了一個數(shù)量級以上，目前臨床上尚未有一次前處理同時檢測多族類抗生素的應(yīng)用。在當(dāng)前我國環(huán)境污染尚未得到有效遏制，且人類持續(xù)暴露低劑量抗生素的危害不斷得到證實(shí)的情況下，本研究的現(xiàn)實(shí)意義在于，避免重復(fù)采樣，更符合人體內(nèi)抗生素殘留水平的監(jiān)測，對于臨床實(shí)施干預(yù)措施，減少抗生素暴露的不良影響提供數(shù)據(jù)支持。

結(jié)合中國現(xiàn)狀，低劑量抗生素除了處方類藥物之外，也存在于肉類和奶制品中。如果母親在懷孕期間食用此類食物，就會長遠(yuǎn)影響孩子的行為，干預(yù)生命體早期發(fā)育。由于本研究監(jiān)測的是食源性抗生素導(dǎo)致的孕產(chǎn)婦體內(nèi)低劑量抗生素的持續(xù)性暴露水平，進(jìn)而研究對于生命早期嬰幼兒發(fā)育的影響，因此目標(biāo)化合物取自文獻(xiàn)或時事報(bào)道的環(huán)境檢測、食品安全檢測等使用和檢出量較多的抗生素種類，而并非目前臨床用藥的常用抗生素。隨著抗生素藥物種類的不斷研發(fā)與上市，本研究方法對于更多種類的抗生素檢測、臨床抗生素的聯(lián)合用藥監(jiān)測等研究的適用性將進(jìn)一步擴(kuò)大；同時由于環(huán)境污染物不僅僅是只有抗生素污染，諸如真菌毒素、農(nóng)藥殘留等都有可能通過人體的持續(xù)攝入而富集和暴露，因此本方法的建立對于其他族類、種類的多種化合物的檢測也具有一定的參考價(jià)值。我們之后研究的方向也將會在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步建立參考方法，優(yōu)化條件，增加更多種類的目標(biāo)化合物的檢測。

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