產(chǎn)前診斷中羊水染色體嵌合體的回顧性分析

禤潔甜 伍啟康

（廣東省佛山市第一人民醫(yī)院 檢驗科，廣東 佛山 528000）

羊水中胎兒脫落細胞培養(yǎng)及染色體核型分析檢查胎兒染色體，依然是目前最常用的產(chǎn)前診斷方法之一，但檢測中出現(xiàn)染色體嵌合體的真實性仍然對臨床遺傳咨詢造成極大的困擾。我們收集、整理了2006～2016年共3422例胎兒羊水產(chǎn)前診斷病例中嵌合體的結(jié)果分析數(shù)據(jù)，希望能給臨床提供更好的指引。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2006～2016年有產(chǎn)前診斷指征，在本院產(chǎn)前診斷中心行羊水穿刺術(shù)，進行胎兒羊水細胞培養(yǎng)及染色體核型分析，共3422例，年齡22～49歲，平均（33.2±2.33）歲，孕周17～25周，平均（22±0.78）周。

1.2 檢測方法

1.2.1 患者在知情同意并簽署知情同意書后，在超聲引導下，進行羊膜腔穿刺抽取羊水20ml（最初抽取的1～2ml羊水棄去），分別注入2支一次性的無菌離心管，1500rmp離心8分鐘，棄上清，余下的細胞懸液分別接種于2個裝有5ml的完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，其中一線為美國生產(chǎn)的Gibco完全培養(yǎng)基，另一線為以色列生產(chǎn)的AMIL2完全培養(yǎng)基，置于37培、5.5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)6天，觀察細胞生長情況做出相應(yīng)的換液、傳代、繼續(xù)培養(yǎng)觀察等相應(yīng)處理，當羊水細胞貼壁生長旺盛，倒置顯微鏡下見多個細胞克隆時，可收獲細胞。每例羊水樣品從接種、培養(yǎng)、收獲、制片（常規(guī)G顯帶，必要時加做C帶或N帶）均分別由兩名技術(shù)人員分別單獨處理，按照ISCN1995標準，油鏡下分析計數(shù)30個細胞，分析5個以上核型，發(fā)現(xiàn)嵌合體時加大計數(shù)和分析100個核型（視可分析的核型數(shù)量而定）。

1.2.2 患者在知情同意并簽署知情同意書后，在超聲引導下，經(jīng)腹部抽取臍血1～2ml（以血紅蛋白電泳方法鑒別是否污染母親血），注入無菌肝素鈉抗凝管，分別接種在2瓶外周血淋巴細胞完全培養(yǎng)液，置于37℃培養(yǎng)68～72小時后收獲，制片過程同羊水。1.3 嵌合體診斷標準 發(fā)現(xiàn)2種或2種以上的核型，參照 Hsu等［1，2］的培養(yǎng)瓶法嵌合現(xiàn)象鑒別方案來進一步分析：在2個或2個以上原位培養(yǎng)物中都至少出現(xiàn)2種或2種以上的異常染色體核型，不同的核型都出現(xiàn)在2個或2個以上的細胞集落，而且異常核型都是相同的，可以診斷為“真性嵌合體”。

2 結(jié)果

2.1 羊水細胞染色體核型及臍血或胎兒組織的染色體核型 3422例產(chǎn)前診斷的羊水標本中，共發(fā)現(xiàn)嵌合體10例（0.29%），其中，性染色體嵌合體8例（80.0%），數(shù)目異常染色體嵌合體2例（20.0%）。同意驗證的8例樣本中有5例與羊水中核型一致，仍然為嵌合體，其中性染色體嵌合體4例（占80.0%）及數(shù)目異常染色體嵌合體1例（20.0%），相符率62.5%。見表1。

2.2 妊娠結(jié)局 10例羊水細胞疑似嵌合體的孕婦中，7例同意抽取臍靜脈血和1例胎死宮內(nèi)同意進行胎兒組織培養(yǎng)驗證胎兒染色體，2例拒絕驗證。驗證結(jié)果中有5例與羊水中核型一致，選擇終止妊娠；驗證結(jié)果為染色體核型正常的3例選擇繼續(xù)妊娠，出生后隨訪，未見異常；2例拒絕驗證，孕婦失訪。

表1 產(chǎn)前診斷中發(fā)現(xiàn)的10例疑似嵌合體的核型及妊娠結(jié)局

3 討論

胎兒羊水細胞培養(yǎng)染色體核型分析是目前產(chǎn)前診斷中應(yīng)用最多、創(chuàng)傷最小、風險較低的一種產(chǎn)前診斷技術(shù)，但在實際工作中，常會遇到胎兒染色體核型為嵌合體的情況。本文的資料顯示，產(chǎn)前診斷中胎兒羊水細胞培養(yǎng)染色體核型分析時出現(xiàn)的嵌合體的比例為0.29%，與國內(nèi)外的文獻報道相似［2，3］。10例嵌合體病例中8例同意行臍血或胎兒組織培養(yǎng)進行驗證，其中有5例驗證結(jié)果與羊水結(jié)果一致，相符率62.5%，驗證相符的病例中，4例為性染色體嵌合體，1例為數(shù)目異常嵌合體，無一例結(jié)構(gòu)異常的嵌合體發(fā)生，這與文獻報道出生人群外周血染色體嵌合體的類型及羊水細胞培養(yǎng)出現(xiàn)的嵌合體類型相似［4，5］。3例臍帶血驗證結(jié)果為正常染色體核型的病例，出生隨訪均為外觀正常的嬰兒，與臍血驗證結(jié)果相符；病例6臍血驗證為正常女性核型的嬰兒，在后期多普勒超聲下的監(jiān)測以及出生后的臨床表型均正常，考慮到臨床上45，X／46，XX嵌合體的女嬰沒有特殊的臨床表型特征，特別是嵌合45，X核型占的比例少，但隨著年齡的增長，生長發(fā)育期的到來，各種表型特征才會有所表現(xiàn)，所以還不能排除嵌合體的可能，有待長期的跟蹤隨訪來驗證羊水、臍血結(jié)果的準確性；就羊水細胞中發(fā)現(xiàn)有嵌合體，而臍血驗證為正常的染色體核型這種現(xiàn)象，也有學者認為羊水細胞源于胎兒體表、泌尿道、呼吸道、消化道等脫落細胞，屬于外胚層、中胚層、內(nèi)胚層，而臍帶血來源于循環(huán)系統(tǒng)，屬于中胚層，兩種不同來源的標本代表的是不同胚層細胞的真實的染色體核型，當遇到羊水細胞培養(yǎng)為嵌合體而臍血驗證為正常的染色體核型時也應(yīng)多普勒超聲下密切觀察胎兒，并在出生后加強隨訪［2，5，6］。

在羊水產(chǎn)前診斷過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)嵌合體的病例，為了有效鑒別假性嵌合體，我們嚴格執(zhí)行雙人雙線培養(yǎng)的方法，并參照Hsu提出的嵌合體診斷標準，有效地鑒別了不少培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了畸變并繼續(xù)生長繁殖成細胞克隆的假性嵌合體，但從驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量的羊水細胞培養(yǎng)及收獲制片也是鑒別羊水染色體嵌合體的前提和關(guān)鍵。3例臍血驗證為正常染色體核型的病例在核型分析過程中其中一線有典型的嵌合體出現(xiàn)，嵌合體的數(shù)量伴隨計數(shù)的核型數(shù)量增多而隨之增多，另一線的核型因分散過度，引起染色體的丟失或散落在其它的核型上，干擾核型的計數(shù)分析結(jié)果及鑒別真假嵌合體。病例8在核型分析過程中，其中一線分析計數(shù)33個核型有5個47，XY，＋21的核型，而且鏡下的核型都非常完整，另外一線計數(shù)30個核型只有一個疑似47，XY，＋21的核型，因為核型中的一條21號染色體在核型的邊上，看似其他核型散落過來，鑒于其中一線嵌合有21號染色體三體，謹慎起見，也計數(shù)在內(nèi)，也就是說只在一線的培養(yǎng)物上有典型的嵌合體，它的產(chǎn)生可能是羊水中脫落的胎兒細胞在體外培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了畸變并繼續(xù)生長繁殖成細胞克隆，但它的這種偶發(fā)性的培養(yǎng)過程的畸變通常只出現(xiàn)在其中的一線的培養(yǎng)物中，而另一線的培養(yǎng)物不會發(fā)生畸變或相同類型的染色體畸變，但因收獲制片時核型過度分散導致參照嵌合體診斷標準也難以鑒別這類型的假性嵌合體。在羊水收獲制片過程中，把控低滲時間、固定液的比例和量、混勻的力度、滴片的力度和距離、室內(nèi)溫濕度等幾個因素，能減少分裂相的破裂或核型分散過度，使鑒別真假嵌合體更準確簡單。

綜上所述，結(jié)合產(chǎn)前診斷的實際工作，在閱片過程中應(yīng)用診斷標準鑒別為真性嵌合體的病例必須進行胎兒臍帶血染色體分析進行驗證，能確保結(jié)果準確性；同時為了減少假性嵌合體的出現(xiàn)：①高質(zhì)量的羊水細胞收獲技術(shù)是鑒別羊水染色體嵌合體的前提和關(guān)鍵，核型的分散度影響染色體的數(shù)目分析，導致鑒別標準也難以鑒別數(shù)目異常的嵌合體的真假。②建立雙線羊水細胞培養(yǎng)或原位培養(yǎng)，有效地鑒別對羊水細胞培養(yǎng)過程中因個別細胞畸變并繼續(xù)生長繁殖成細胞克隆而產(chǎn)生的假性嵌合體，避免給孕婦及其家人帶來不必要的心理壓力及二次的創(chuàng)傷。

［1］ 高淑英，司艷梅，薛虹，等.關(guān)于產(chǎn)前診斷絨毛細胞和羊水細胞中嵌合現(xiàn)象［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2007，15：11-52.

［2］ Hsu LY，Perlis TE.United States suivey on chromosome mosaicism and pseudomosaicism in prenatal diagnosis［J］.Prenat Diagn，1984，4：97-130.

［3］ 陳鐵峰，毛倩倩，鄒波，等。1848例妊娠中期羊水細胞染色體核型分析［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2011，19：32-37.

［4］ 謝志威，張晶，李衛(wèi)凱，等.江門地區(qū)3782李遺傳咨詢者外周血染色體核型分析［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2013，7：58-60.

［5］ Hsu LY，Yu MT，Richkind KE，et al.Incidence and significance of chromosome mosaicism involving an autosomal structural abnormality diagnosed prenataly through amniocentesis：a collaborative study［J］.Prenat Diagn，1996，16：1-28.

［6］ 張璘，任梅宏，宋桂寧，等.產(chǎn)前診斷中有關(guān)染色體嵌合體的診斷、處理及臨床分析［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2015，10：54-57.