優(yōu)化的羊水細(xì)胞培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)結(jié)果分析

鄭嬌 李春艷 程璐 徐慧 郭芬芬 徐盈 燕鳳 陳必良 張建芳

（空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 婦產(chǎn)科，陜西 西安 710000）

染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)畸變導(dǎo)致的染色體病是導(dǎo)致出生缺陷的重要原因［1］。近年來基因芯片、Bobs等產(chǎn)前診斷新技術(shù)開展，使產(chǎn)前診斷與遺傳咨詢指導(dǎo)更精準(zhǔn)更詳細(xì)，但羊水細(xì)胞染色體分析技術(shù)作為最傳統(tǒng)的染色體檢測發(fā)法依舊是產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，是診斷染色體病的最重要的手段［2，3］。然而，由于培養(yǎng)條件、羊水質(zhì)量、孕婦個體差異、宮內(nèi)環(huán)境等諸多方面因素的影響，羊水細(xì)胞培養(yǎng)仍具有一定難度。這直接影響后期染色體制備，分裂相的多少與優(yōu)劣，核型分散度和形態(tài)等。經(jīng)過長期摸索，以及幾種羊水培養(yǎng)方法的比較，本研究室篩選出一種較優(yōu)良的羊水培養(yǎng)方法，研究表明改良的羊水培養(yǎng)方法能顯著提高羊水培養(yǎng)成功率，對提高產(chǎn)前診斷準(zhǔn)確率和工作效率都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象 根據(jù)知情同意原則應(yīng)用優(yōu)化羊水細(xì)胞培養(yǎng)方法對2017年1月至2017年11月來我院就診的具有產(chǎn)前診斷指征、自愿行產(chǎn)前診斷的2772例孕婦（孕周16～33周）的羊水標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、染色體制片以及和核型分析。

1.2 儀器與試劑 Panasonic公司培養(yǎng)箱；OLYMPUS倒置顯微鏡；湘儀公司TDZ5-WS離心機(jī)；BI公司的BIOAMF-2羊水培養(yǎng)基；CHANG A-mino羊水培養(yǎng)基；廣州白云山羊水培養(yǎng)基；Corning無菌15ml離心管；Corning430639 25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

1.3 方法 羊水采集由臨床醫(yī)生在B超引導(dǎo)下，經(jīng)腹穿刺后用20ml注射器抽取羊水20ml左右，放置于保溫包盡快送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.3.1 接種 羊水快速轉(zhuǎn)移至15ml無菌離心管，15 000rpm離心5分鐘，棄上清，余大約0.5～1ml羊水重懸沉淀物，然后接種于裝有4.5ml羊水培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。輕輕晃動，使液體鋪滿瓶底，放置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行靜置培養(yǎng)4～5天后，顯微鏡下觀察或肉眼可見成堆聚集的細(xì)胞克隆或是散在的貼壁細(xì)胞后方可換液。換液2～3天后，細(xì)胞呈大克隆，中期狀態(tài)細(xì)胞較多時可進(jìn)行收獲。加入5μl（10μg／ml）秋水仙素，輕輕搖，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3小時。

1.3.2 消化 取出培養(yǎng)瓶棄掉培養(yǎng)基，加入2ml 0.25%胰酶于37℃培養(yǎng)箱放置2分鐘，加入培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復(fù)吹打直至細(xì)胞從瓶壁脫落且無肉眼可見細(xì)胞團(tuán)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpm 8分鐘離心。

1.3.3 低滲 棄上清，加入5ml低滲液（2mg／ml氯化鉀＋2mg／ml檸檬酸鈉）重懸后37℃孵育13分鐘，加入1ml甲醇∶冰醋酸＝3∶1固定液輕輕混勻后預(yù)固定5分鐘，1800rpm離心8分鐘。

1.3.4 固定 棄上清，加入5ml甲醇∶冰醋酸＝3∶2固定液重懸室溫放置30分鐘，2000rpm 8分鐘離心，棄上清，加入5ml甲醇∶冰醋酸＝3∶2固定液重懸放置于4℃過夜。

1.3.4 制片、干燥及分帶 次日取出至恢復(fù)室溫后2000rpm 8分鐘離心，棄上清，加入3～4滴甲醇∶冰醋酸＝2∶1固定液重懸制片，75℃干燥3小時，G顯帶。

在羊水培養(yǎng)過程中，對于血性羊水、有胎糞污染羊水、孕周偏小或大羊水等幾種情況羊水的培養(yǎng)方法如下：①血性羊水的培養(yǎng)：如果離心后有大量血細(xì)胞存在，一般采取提前換液的方法。培養(yǎng)3～4天后顯微鏡下觀察是否有貼壁細(xì)胞，若有細(xì)胞已貼壁，晃動培養(yǎng)瓶并棄掉培養(yǎng)基，加1ml培養(yǎng)基再次晃動培養(yǎng)瓶，沖洗瓶壁上附著的血細(xì)胞后再次棄掉培養(yǎng)基，再重新加入5ml新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)直到有大量細(xì)胞克隆出現(xiàn)。②有胎糞污染羊水的培養(yǎng)：對于有胎糞污染或者是其他雜質(zhì)較多的羊水，培養(yǎng)4天后顯微鏡下觀察如有細(xì)胞貼壁可沖洗后提前換液；也可以在培養(yǎng)1小時后輕輕取出培養(yǎng)瓶，用吸管輕輕吸出上清（其中包含大量還未貼壁的羊水細(xì)胞）重新接種于新的培養(yǎng)瓶中后按正常方法進(jìn)行培養(yǎng)。③孕周偏小（＜18周）羊水的培養(yǎng)：孕周偏小，羊水里游離細(xì)胞量較少，活性細(xì)胞也較少，離心后可見很少量沉淀，接種后可稍微延長培養(yǎng)時間，較正常細(xì)胞晚2～3天換液。④孕周偏大（＞26周）羊水的培養(yǎng)：大孕周羊水里細(xì)胞較多，但活性細(xì)胞較少。可在離心后稀釋羊水濃度，分多瓶培養(yǎng)促進(jìn)羊水細(xì)胞貼壁。對于孕周過大且含有大量胎脂羊水，須在培養(yǎng)4天后顯微鏡下觀察，如有細(xì)胞貼壁須提前換液。

羊水培養(yǎng)過程中，細(xì)胞克隆較少或者克隆過老的情況下需要消化刺激或傳代，以下游兩種消化方法：①胰酶消化法：棄掉培養(yǎng)基，加入2ml 0.25%胰酶37l培養(yǎng)箱放置2分鐘，加入2ml培養(yǎng)基中止消化并對著瓶壁反復(fù)吹打直至貼壁細(xì)胞都重懸后轉(zhuǎn)移至15ml離心管1 200rpm離心5分鐘，加新鮮培養(yǎng)基重懸后重新種植入培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)。②細(xì)胞刮刮細(xì)胞法：棄掉培養(yǎng)基，加入2ml新鮮培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮（NUNC公司）刮細(xì)胞，然后用吸管反復(fù)吹打后再加入3ml培養(yǎng)基原瓶培養(yǎng)或一傳二繼續(xù)培養(yǎng)。

2 結(jié)果

采用上述培養(yǎng)方法，通過對臨床采集2017年1月至2017年11月的2772例羊水進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果如表1，結(jié)果異常的見表2。

3 討論

羊水細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，影響因素較多［4，5］。首先，羊水細(xì)胞的采集、運(yùn)輸、接種一直到后期的培養(yǎng)都需要無菌條件［6］，從采集到運(yùn)輸、接種過程必須快速進(jìn)行。羊水細(xì)胞培養(yǎng)后前幾天貼壁時間必須靜置，防止挪動，否則直接影響細(xì)胞貼壁。細(xì)胞培養(yǎng)箱的溫度、濕度和CO2濃度是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，特別是CO2濃度必須控制在（5±0.5）%，這直接影響到羊水細(xì)胞是否能夠生長存活的必要條件。羊水培養(yǎng)基的選擇也至關(guān)重要，建議在培養(yǎng)時兩種培養(yǎng)基同時平行培養(yǎng)，以便對照同時也可以防止意外情況的發(fā)生。

表1 2772例羊水細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

表2 2772例水細(xì)胞培養(yǎng)中異常結(jié)果分類

血性羊水培養(yǎng)成功率低主要是因?yàn)檠?xì)胞的存在，影響羊水細(xì)胞的貼壁和生長。提前換液減少血細(xì)胞的影響，同時新鮮培養(yǎng)基可為羊水細(xì)胞的增殖提供充足的養(yǎng)分促進(jìn)生長；對于有胎糞污染或其他雜質(zhì)含量較多的此類質(zhì)量較差的羊水，在接種1小時后吸出上清重新接種是由于在1小時內(nèi)雜質(zhì)由于重力作用提前沉淀至瓶底，而羊水細(xì)胞還未貼壁。故重新接種可有效去除其他方式無法去掉的雜質(zhì)從而改善羊水生長的微環(huán)境。

許多B超結(jié)果明顯異常、生有異常染色體疾病的患兒、或是夫妻雙方自身染色體異常以及夫妻雙方攜帶某種單基因或染色體病的孕婦會在孕周較小的時候來進(jìn)行遺傳咨詢，這樣抽取羊水的孕周較小導(dǎo)致活性細(xì)胞較少難培養(yǎng)的羊水細(xì)胞在培養(yǎng)時可適當(dāng)減少培養(yǎng)基，人為提高細(xì)胞濃度進(jìn)行培養(yǎng)；也可通過適當(dāng)延長貼壁時間，晚2～3天換液，保證活性細(xì)胞完全貼壁。對于一些在較大孕周才發(fā)現(xiàn)B超異?；蜓蛩慨惓５脑袐D，抽取羊水時間較晚導(dǎo)致羊水中死細(xì)胞過多活性細(xì)胞過少，含有胎脂等因素導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)難度增大［7］。對于此類羊水需人為稀釋羊水濃度，多接種一瓶，尤其含有胎脂的羊水必須提前換液，或多次換液［8］以減少死細(xì)胞以及胎脂對羊水貼壁的影響。

羊水細(xì)胞在換液后觀察若克隆較少（3～4個），直接收獲可能導(dǎo)致分裂項(xiàng)偏少，則需要原瓶消化刺激后再培養(yǎng)1～2天待細(xì)胞密度達(dá)60%～70%再收獲。對于細(xì)胞克隆較老的羊水，可消化刺激后再進(jìn)行收獲。在細(xì)胞傳代時，對于克隆少細(xì)胞狀態(tài)良好生長旺盛的羊水細(xì)胞建議細(xì)胞刮刮細(xì)胞法進(jìn)行；對于細(xì)胞克隆較老的羊水細(xì)胞建議用胰酶消化的方式進(jìn)行傳代?？傮w來說，細(xì)胞刮刮細(xì)胞法對羊水細(xì)胞的損傷較?。?］，傳代后貼壁時間也較短，是一種比較理想的細(xì)胞傳代方法。

羊水培養(yǎng)成功是進(jìn)行染色體核型分析的前提條件，是產(chǎn)前診斷遺傳咨詢的重要依據(jù)［10］，對預(yù)防出生缺陷意義重大［11］。從羊水采集到收獲制片過程復(fù)雜漫長，每個環(huán)節(jié)都可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。本實(shí)驗(yàn)室用以上所述優(yōu)化的羊水細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)成功率達(dá)99.9%以上，綜上所述，羊水細(xì)胞的培養(yǎng)需要在操作過程中因個體差異而異，需要根據(jù)不同羊水的狀態(tài)細(xì)化操作方能提高培養(yǎng)成功率。

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