鐵線蓮Inspiration組培繼代培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化

楊利平 陳乃明 王鵬良 陳麗文 楊瓊 李芳菲 何貴整

摘要：以三年生鐵線蓮Inspiration當(dāng)年萌發(fā)的新芽為外植體獲得無菌芽，從MS營養(yǎng)元素成分及植物生長調(diào)節(jié)劑2個(gè)方面探究最適宜鐵線蓮Inspiration繼代增殖的培養(yǎng)基組成。結(jié)果表明，大量元素對繼代培養(yǎng)的影響最大，鐵鹽次之，微量元素影響最小，鐵元素濃度低于MS全量時(shí)，鐵線蓮Inspiration繼代苗葉片發(fā)黃，繼代培養(yǎng)基營養(yǎng)成分最優(yōu)組合為1/2大量元素+1/4微量元素+1/3有機(jī)物+3/2鐵鹽;6-BA與NAA間存在互作關(guān)系，濃度比值在3～6之間時(shí)，叢生芽的增殖效果最好，增殖系數(shù)在2.5以上，經(jīng)篩選優(yōu)化，最優(yōu)激素配比組合為6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L。最優(yōu)營養(yǎng)元素和最優(yōu)激素的組合可使得鐵線蓮Inspiration繼代增殖系數(shù)達(dá)到2.76。

關(guān)鍵詞：鐵線蓮Inspiration;繼代培養(yǎng);篩選;優(yōu)化

中圖分類號：S687.304+.3? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0083-04

鐵線蓮為毛茛科（Ranunculaceae）鐵線蓮屬（Clematis L.）植物，是一種觀賞價(jià)值高、抗逆性強(qiáng)的藤本花卉，該物種共有300余種原生種，廣泛分布于各大洲，其中以北半球的亞熱帶和溫帶地區(qū)為多[1-3];我國有近50%原生種，分布范圍北至吉林省，南至云南省[4]。該物種花大葉美，主要用于庭院綠化和園林造景，被譽(yù)為“攀緣植物皇后”，另外根和全草可供藥用，根具有通經(jīng)絡(luò)、解毒、祛瘀之效，可治療痛風(fēng)和蟲蛇咬傷，具有重要的藥用價(jià)值。

鐵線蓮品種Inspiration的花瓣呈深粉紅色，輪轉(zhuǎn)形排列，雄蕊呈黃色，花色美麗，花期較長，非常適合依托針葉和落葉灌木生長，是一個(gè)理想的盆栽品種。鐵線蓮屬植物存在結(jié)實(shí)少，種子發(fā)芽率低，栽培品種大多為雜交種，種子繁殖無法保證其品種的特性[5]，分株繁殖速度較慢等特點(diǎn);通常鐵線蓮繁殖方式以扦插繁殖為主，但扦插繁殖系數(shù)較低，且不易生根，品種易退化[6-7]。這就導(dǎo)致了種苗不夠充足，無法滿足市場需求。

目前，花卉企業(yè)的鐵線蓮屬植物多以進(jìn)口為主，且苗木價(jià)格普遍偏高[8-9]。因此建立鐵線蓮的組培快繁技術(shù)體系可有效解決以上種苗繁育過程中存在的問題。目前相關(guān)文獻(xiàn)對鐵線蓮組培體系的建立主要通過愈傷組織實(shí)現(xiàn)，容易造成突變[4，8]，但極少采用以芽繁芽方式，采用以芽繁芽方式獲得的苗木能較好地保持品種的穩(wěn)定性。本研究首先采用腋芽為外植體獲得無菌芽，進(jìn)而進(jìn)行繼代培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和激素配比的篩選及優(yōu)化，旨在提高鐵線蓮Inspiration的繁殖效率，為該品種產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以三年生的鐵線蓮Inspiration植株為材料，以其當(dāng)年生帶芽莖段為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌芽的獲得

春季晴天從三年生鐵線蓮品種Inspiration健壯無病蟲害的當(dāng)年新生枝條上剪取帶芽莖段，去除葉片，并將莖段剪成8～10 cm長度，放入容器內(nèi)用洗潔精水溶液浸泡5 min，用軟毛牙刷刷洗后，用清水清洗5～6次，瀝干后，置超凈臺(tái)上備用。將表面清洗過的外植體用0.1% HgCl2溶液消毒7～12 min后，用滅菌水清洗5～6次，在超凈臺(tái)上切成2 cm左右的莖段，每個(gè)莖段保留1～2個(gè)腋芽，將處理后的莖段接種到繼代培養(yǎng)基上，為防止交叉污染，每瓶培養(yǎng)基接種1條莖段，培養(yǎng)基選用未添加任何激素的MS培養(yǎng)基，待萌出新芽后，轉(zhuǎn)至MS+0.5 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.05 mg/L 萘乙酸（NAA）的培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

1.2.2 增殖培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的篩選

試驗(yàn)選用MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，大量元素（D）、微量元素（W）、有機(jī)成分（Y）、鐵鹽（F）為試驗(yàn)因子，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，忽略因子間交互作用，按照L9（34）正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)，各因子水平及濃度配比見表1、表2，培養(yǎng)基附加：蔗糖30 g/L，瓊脂6 g/L，6-BA 0.5 mg/L，NAA 0.05 mg/L，培養(yǎng)基pH值為5.8～6.0。每個(gè)處理5瓶，每瓶接種5株外植體，3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 組培繼代苗激素組合的優(yōu)化

本試驗(yàn)采用二因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選用“1.2.2”節(jié)中獲得的最優(yōu)營養(yǎng)元素組合培養(yǎng)基，將長勢基本一致的不定芽從基部切下，接種于添加不同濃度6-BA（0.20、040、0.60 mg/L）和NAA（0.05、0.10、0.20 mg/L）的培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種5個(gè)芽，4個(gè)重復(fù)。

1.2.4 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件：溫度（25±2） ℃，相對濕度60%～70%，光照度 1 500～2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d[10]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)過程中每1周觀察1次芽誘導(dǎo)情況，繼代苗接種4周后觀察并記錄數(shù)據(jù)。增殖系數(shù)=增殖后不定芽總數(shù)/接種的不定芽總數(shù)。采用高級版DPSv17.10對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌芽的獲得

將鐵線蓮Inspiration外植體消毒后接種至培養(yǎng)基上，7 d后腋芽開始萌動(dòng)（圖1），培養(yǎng)至14 d時(shí)大部分莖段的腋芽已萌動(dòng)。待腋芽逐漸伸長至3～5 cm 后，去除頂端優(yōu)勢，轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng) 28 d 左右形成叢生芽（圖2）。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，雖在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，但冬季Inspiration的增殖效果較春、夏、秋季依然略低，這可能與鐵線蓮屬多年生草本植物在自然條件下冬季落葉有關(guān)。

2.2 MS培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的差異比較

由表3可見，在正交試驗(yàn)的試驗(yàn)組合中，MS培養(yǎng)基中大量元素及鐵鹽濃度對鐵線蓮Inspiration繼代增殖存在影響，P值均小于0.01，達(dá)到極顯著性水平，這說明MS培養(yǎng)基的大量元素和鐵鹽對鐵線蓮品種Inspiration的生長有極顯著影響，而微量元素及有機(jī)物濃度影響則不顯著。從表4可以看出，大量元素濃度為基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基的1/2時(shí)，鐵線蓮Inspiration繼代增殖效果最佳，增殖系數(shù)達(dá)到2.33，且與1/3濃度水平差異極顯著;而鐵鹽濃度為基礎(chǔ)培養(yǎng)基濃度的3/2時(shí)對鐵線蓮Inspiration繼代增殖的效果最好。

由表5分析可知，繁殖系數(shù)在不同組合間差異較大，繁殖系數(shù)最高為2.74，最低為1.70，二者差異極顯著;由極差R值的大小順序可知，4個(gè)因子的主次順序?yàn)镈>F>Y>W，即大量元素對鐵線蓮Inspiration的繼代增殖影響最大，鐵鹽次之，微量元素影響最小。鐵鹽濃度低于基本MS培養(yǎng)基時(shí)，導(dǎo)致鐵線蓮Inspiration繼代苗葉色偏黃。綜上所述，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分最優(yōu)組合為D2W1Y2F3，即1/2大量元素+1/4微量元素+1/3有機(jī)物+3/2鐵鹽。

從表5還可以看出，大量元素濃度降低至基礎(chǔ)MS培養(yǎng)基的1/3時(shí)，鐵線蓮Inspiration繼代增殖系數(shù)明顯降低，且與1/2濃度和全量濃度水平產(chǎn)生較大差異，說明大量元素在鐵線蓮Inspiration繼代增殖過程中起關(guān)鍵作用。微量元素及有機(jī)物濃度在1/4～1/2之間變化時(shí)，鐵線蓮Inspiration繼代增殖系數(shù)變化未表現(xiàn)出明顯規(guī)律性。同時(shí)，表5中反映出隨著鐵鹽濃度的升高，增殖系數(shù)有增加的趨勢。

2.3 不同激素水平對鐵線蓮Inspiration繼代增殖影響的差異比較

雙因素方差分析結(jié)果（表6）顯示，6-BA濃度

（A因素）、NAA濃度（B因素）對鐵線蓮Inspiration繼代增殖系數(shù)均產(chǎn)生顯著影響，且6-BA和NAA之間存在顯著互作關(guān)系。隨著6-BA濃度增加，增殖系數(shù)有增加的趨勢（表7），但當(dāng)6-BA濃度達(dá)到0.6 mg/L[CM（17*2/3]時(shí)，叢生芽雖多但細(xì)弱，不利于后續(xù)生根誘導(dǎo)。6-BA與NAA濃度比值在3～6之間時(shí)，叢生芽的增殖效果最好，增殖系數(shù)在2.5以上。綜合對比不同激素配比下叢生芽的增殖系數(shù)及生長狀況發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)激素配比組合為6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

3 結(jié)論與討論

目前對鐵線蓮組培體系的建立主要通過愈傷組織實(shí)現(xiàn)[4，6]，鐵線蓮組培苗增殖系數(shù)因品種差異在2.0～4.18間浮動(dòng)[8-9，11]。本研究從MS營養(yǎng)元素成分及植物生長調(diào)節(jié)劑2個(gè)方面探究了最適宜鐵線蓮Inspiration繼代增殖的培養(yǎng)基組成，結(jié)果表明，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分影響繼代苗增殖系數(shù)及長勢，其中大量元素的影響最大，鐵鹽次之，微量元素影響最小;植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA存在互作關(guān)系，隨著6-BA濃度的增加，繼代增殖系數(shù)有增加趨勢，但當(dāng)6-BA濃度濃度到達(dá)0.6 mg/L時(shí)，叢生芽細(xì)弱，不利于后續(xù)培養(yǎng)。本研究篩選并優(yōu)化出了最適宜鐵線蓮Inspiration繼代增殖的培養(yǎng)基，為1/2大量元素+1/4微量元素+1/3有機(jī)物+3/2鐵鹽的改良MS培養(yǎng)基并添加0.4 mg/L 6-BA和 0.1 mg/L NAA，該組合下增殖系數(shù)可達(dá)到2.76，且叢生芽長勢健壯。

本研究發(fā)現(xiàn)，鐵線蓮Inspiration對鐵元素的需求量較大，鐵鹽濃度低導(dǎo)致鐵線蓮Inspiration繼代苗葉片發(fā)黃，當(dāng)鐵鹽濃度達(dá)到MS全量濃度的1～3/2 時(shí)，這種情況會(huì)明顯改善。這可能與鐵元素參與葉綠素生物合成有關(guān)，鐵元素雖然不是葉綠素的組成成分，但影響光能吸收和光合電子傳遞，是多種酶的組成成分，因此，葉綠素合成過程中必須有鐵元素[12]。報(bào)道顯示，在多種植物必需礦物元素中，鐵是需求量最大的，它在多種生化反應(yīng)中起重要作用[13]。

雖然在一定程度上組培育苗較傳統(tǒng)繁殖方式更容易控制環(huán)境條件，但在研究過程中發(fā)現(xiàn)，鐵線蓮Inspiration在培養(yǎng)室中冬季的長勢不及春、夏、秋季，冬季的增殖系數(shù)較低，且葉的長勢欠佳，這可能與鐵線蓮屬多年生草本植物在自然條件下冬季落葉有關(guān)。

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收稿日期：2019-07-29

基金項(xiàng)目：欽州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃（編號：201616802）。

作者簡介：楊利平（1984—），女，河南許昌人，碩士，高級工程師，主要從事花卉的種苗繁育及栽培技術(shù)研究。E-mail：278291930@qq.com。

通信作者：何貴整，高級工程師，主要從事林木、花卉的育種、育苗及栽培產(chǎn)業(yè)化技術(shù)研究。E-mail：13807776795@163.com。