熱帶假絲酵母唑類耐藥相關基因的研究進展

唐娜，郭大文

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，哈爾濱 150001

熱帶假絲酵母唑類耐藥相關基因的研究進展

唐娜，郭大文

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，哈爾濱 150001

臨床上熱帶假絲酵母(又稱熱帶念珠菌)的分離率越來越高，唑類抗真菌藥物因較低的細胞毒性且大多可口服給藥，是治療熱帶念珠菌感染的常用藥物。我國耐唑類藥物熱帶念珠菌的分離率較高，因此有必要了解其具體機制，為尋求新的藥物作用靶點提供依據(jù)。目前認為,與熱帶念珠菌唑類耐藥有關的主要機制有靶基因ERG11過度表達和突變、編碼轉錄因子的upc2基因過度表達和突變、外排泵基因過度表達及其他相關基因過度表達等。本文就目前熱帶念珠菌唑類耐藥機制的基因水平研究進展進行綜述。

熱帶假絲酵母；ERG11基因；唑類耐藥；基因突變

假絲酵母(又稱念珠菌)屬引起的真菌感染在世界范圍內顯著增多，非白念珠菌(non-albicansCandida，NACA)的分離率也逐年上升[1]。幾十年來，熱帶念珠菌在不同地域的癌癥、中性粒細胞減少癥、惡性腫瘤和長期藥物治療患者中已成為排名一二的NACA[2]。研究發(fā)現(xiàn)，耐唑類藥物熱帶念珠菌的分離率呈上升趨勢[3-4]。中國侵襲性真菌耐藥監(jiān)測網(CHIF-NET)數(shù)據(jù)顯示[4]，近5年(2009年8月—2014年7月)氟康唑的耐藥率從11.2%增至42.7%，伏立康唑的耐藥率從10.4%增至39.1%；2013—2014年耐唑類藥物熱帶念珠菌的分離率呈迅速上升趨勢，且分離率上升與臨床藥物使用量無關。全球SENTRY監(jiān)測報告顯示[5]，來自31個國家(2013年)的熱帶念珠菌中，氟康唑耐藥率為 11.6%，其中 81.8% 來自亞太地區(qū)，31.8% 來自中國。

1 靶基因ERG11過度表達和突變

1.1 唑類藥物的作用靶酶

14-α去甲基化酶(14α-demethylase，14-DM)是麥角固醇合成的關鍵酶，由ERG11基因編碼合成[6]。麥角固醇是維持細胞膜正常的結構，是念珠菌細胞膜的主要固醇，可影響多種膜結合酶的功能。固醇合成階段包括形成角鯊烯、角鯊烯轉化為羊毛甾醇后生成麥角固醇，其中麥角固醇的形成是真菌合成固醇的特有階段[7]。唑類藥物與14-DM結合，阻止酶底物與14-DM結合，影響羊毛甾醇14α-甲基的羥基化反應，從而抑制真菌細胞膜中麥角固醇的生物合成，發(fā)揮抗真菌作用。

1.2 ERG11過度表達

ERG11過度表達增加了細胞中靶酶的量，需更高效力的唑類藥物與靶酶結合才能達到抑菌效果[6]。研究證實，耐氟康唑熱帶念珠菌中ERG11過度表達[8-11]。Jiang等[8]研究中國52株來自臨床的熱帶念珠菌發(fā)現(xiàn)，耐唑類藥物熱帶念珠菌中ERG11平均表達水平高于敏感菌4倍以上，麥角甾醇含量增加，對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑均耐藥的分離株中ERG11表達水平比單獨耐氟康唑或伊曲康唑的分離株更高。

1.3 ERG11突變

ERG11突變可引起其編碼的酶的活性和三維結構發(fā)生改變，降低其對唑類藥物的親和力，使藥物不能有效發(fā)揮作用[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，熱帶念珠菌中越來越多的ERG11突變與唑類耐藥相關。耐唑類藥物熱帶念珠菌中，可能與耐藥相關的氨基酸置換有D81A[12]、Y132F[8-9,12-13]、S154F[7-9,12]、R245K[10]、Y221F[10]、V362I[10]、K143Q[9]、K143R[14]等。部分研究[8-9,12]發(fā)現(xiàn)Y132F和S154F在耐藥株中同時出現(xiàn)，有實驗[8]證實ERG11突變導致的Y132F和S154F置換降低了釀酒酵母對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑(尤其是對氟康唑和伊曲康唑)的敏感性。有研究發(fā)現(xiàn)[14-15]K143Q、K143R置換位于ERG11的唑類結合活性位點附近。根據(jù)建立的蛋白質同源性模型和Chau等[16]的研究，認為K143Q、K143R置換可能引起熱帶念珠菌對唑類藥物耐藥。由于14-DM的活性位點在血紅素遠端，深埋于蛋白內部，唑類藥物需通過較長的通道才能到達[17]。三維分子建模軟件分析表明，D81A、Y132F和S154F分別位于唑類藥物進出通道的上方、通道內和通道開口,可能影響唑類藥物進入通道，導致14-DM與氟康唑的親和力下降而產生耐藥[12]。在耐唑類藥物熱帶念珠菌中發(fā)現(xiàn)的氨基酸置換，還需進一步的實驗證實和全面的流行病學研究以確定具體機制。在氟康唑劑量依賴株和氟康唑耐藥株的ERG11中也會出現(xiàn)某些沉默突變，雖不改變氨基酸序列，但可能影響蛋白與藥物相互作用位點的結構[18]。因此，熱帶念珠菌ERG11基因的沉默突變可能與耐藥有關，還須進一步研究證實。

2 upc2基因過度表達和突變

2.1 鋅族轉錄因子Upc2p

upc2基因編碼鋅族轉錄因子Upc2p，這是一種具有調控基因表達功能的蛋白，為真菌所特有。已證明，ERG11的上調和突變是熱帶念珠菌耐唑類藥物的主要機制之一[8]。Upc2p具有轉錄調節(jié)功能，可調控ERG11表達，有必要對其進一步研究。目前，對熱帶念珠菌upc2的研究較少，但越來越受重視。

2.2 upc2基因過度表達和突變

Jiang等研究upc2的表達和序列改變，結果顯示31株耐唑類藥物熱帶念珠菌中upc2顯著過度表達[19]，對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑均耐藥的分離株中upc2表達水平比單獨氟康唑或伊曲康唑耐藥株更高。upc2啟動子區(qū)域含有T118G和G155A突變，兩種突變可同時存在(在多重耐藥分離株中始終同時存在)。他們還檢測到G392E置換，并以釀酒酵母為表達宿主，證明G392E置換可顯著降低釀酒酵母對氟康唑和伊曲康唑的敏感性。Choi等[11]對熱帶念珠菌upc2進行測序，發(fā)現(xiàn)突變基因導致的氨基酸置換，但這些突變出現(xiàn)在未過表達ERG11的氟康唑敏感菌株中，因此進一步研究upc2基因的改變對調控ERG11功能的影響很有必要。upc2過度表達和突變對ERG11的影響而導致的耐藥還需更多研究證實，未來可深入研究upc2啟動子 T118G和G155A突變在熱帶念珠菌Upc2p轉錄調控ERG11中的具體作用。

3 外排泵基因cdr1和mdr1過表達

3.1 外排泵ABCT和MFS

目前認為，真菌細胞中與唑類耐藥相關的外排泵主要有兩類: 一類是ATP結合盒轉運蛋白家族(ATP binding cassette transporter，ABCT)，為一種能量依賴型外排泵，通過水解ATP獲得能量，以主動轉運的方式增加藥物外排，從而降低細胞內藥物濃度而產生耐藥; 另一類是主要易化擴散載體超家族( major facilitator superfamily，MFS)，為非能量依賴型載體，主要依靠跨膜質子濃度差，以被動運輸?shù)姆绞较蚣毎獗贸鏊幬铮档图毎麅人幬餄舛榷a生耐藥[20]?？赡芘c熱帶念珠菌唑類耐藥相關的外排泵有：cdr1基因編碼的Cdr1p是對唑類藥物產生耐藥的最主要ABCT，mdr1編碼的Mdr1p是近年來關于唑類耐藥研究最多的MFS[20]。

3.2 外排泵基因cdr1和mdr1過表達

謝宏等[20]針對藥物外排泵基因，對臨床分離的熱帶念珠菌氟康唑敏感株和耐藥株中的cdr1和mdr1表達進行研究，結果顯示兩種外排泵基因在敏感株和耐藥株中均有表達，且耐藥株中的表達高于敏感株，與文獻[10,21]報道一致。Choi等[11]分析熱帶念珠菌發(fā)現(xiàn)，mdr1和cdr1表達在氟康唑低敏感株 (最低抑菌濃度1～2 μg/mL)和氟康唑不敏感株 (最低抑菌濃度4～64 μg/mL)中均明顯高于對照組(最低抑菌濃度 0.125～0.5 μg/mL)。有學者在耐唑類藥物熱帶念珠菌中也觀察到ABCT上調[14]，認為外排泵基因的過度表達可能與熱帶念珠菌耐唑類藥物相關。有研究顯示，氟康唑耐藥株mdr1過表達率顯著高于敏感株，而耐藥株cdr1過表達率與敏感株無顯著統(tǒng)計學差異，表明熱帶念珠菌臨床分離株的耐藥與MFS高表達相關[9]。Jiang等[8]研究mdr1和cdr1表達時發(fā)現(xiàn)，氟康唑敏感株與耐藥株之間無顯著差異，與Vandeputte等[22]的研究結果一致。因此有學者認為，與ERG11相比，外排泵基因似乎在熱帶念珠菌耐唑類藥物中不起關鍵作用。目前為止，直接描述這些外排泵基因潛在作用的實驗尚未在熱帶念珠菌中進行，仍需進一步的實驗證實和全面的流行病學研究。

4 其他相關基因的過度表達

有研究發(fā)現(xiàn)[23]，耐唑類藥物熱帶念珠菌中，sod、oat、acoat、dapaat和abat這5種基因過度表達可能是唑類耐藥的潛在新標記。5種基因編碼的酶包括涉及抗氧化防御的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、鳥氨酸氨基轉移酶(ornithine aminotransferase，OAT)、乙酰鳥氨酸氨基轉移酶(acetylornithine aminotransferase，ACOAT)、腺苷甲硫氨酸-8-氨基-7-氧代壬酸氨基轉移酶(diaminopelargonic acid aminotransferase，DAPA AT)和4-氨基丁酸氨基轉移酶(4-aminobutyrate aminotransferase，ABAT)。后4種屬于磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)依賴酶，在許多真菌細胞周期中發(fā)揮重要生理作用。大多數(shù)抗真菌藥物可通過在酵母細胞中產生高水平的胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導細胞死亡。SOD可催化超氧自由基向過氧化氫和二氧化碳轉化，在保護細胞免受超氧化物毒性方面發(fā)揮重要作用[24]。耐唑類藥物熱帶念珠菌中sod過度表達，可能減少ROS誘導的細胞死亡，從而使熱帶念珠菌產生耐藥。oat、acoat、dapaat和abat編碼的酶屬于PLP依賴性天冬氨酸氨基轉移酶家族，在三羧酸循環(huán)前體生成中起主要作用，其過度表達導致真菌細胞產生大量ATP。念珠菌產生耐藥的機制之一是真菌細胞膜上的ABCT通過ATP水解獲得能量，從而有效將藥物排出細胞外[25]。耐唑類藥物熱帶念珠菌中oat、acoat、dapaat和abat過度表達，產生大量ATP，有助于ABCT將細胞內藥物排除而產生耐藥。綜上所述，sod、oat、acoat、dapaat和abat過度表達可能與熱帶念珠菌耐唑類藥物有關。

5 結語

熱帶念珠菌的唑類耐藥率升高給臨床治療帶來了阻力，耐藥性的形成與相關耐藥基因的過度表達和突變有一定關聯(lián)。但耐藥機制有多種，相互之間作用復雜，仍需不斷深入研究，從而為臨床提供參考和理論依據(jù)。

[1] González GM, Trevio-Rangel Rde J, Palma-Nicolás JP, Martínez C, González JG, Ayala J, Caballero A, Morfín-Otero R, Rodríguez-Noriega E, Velarde F, Ascencio EP, Tinoco JC, Vázquez JA, Cano MA, León-Sicairos N, González R, Rincón J, Elías MA, Bonifaz A. Species distribution and antifungal susceptibility of bloodstream fungal isolates in paediatric patients in Mexico: a nationwide surveillance study [J]. J Antimicrob Chemother, 2013, 68(12): 2847-2851.

[2] Negri M, Silva S, Henriques M, Oliveira R. Insights into Candida tropicalis nosocomial infections and virulence factors [J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2012, 31(7): 1399-1412.

[3] Xiao M, Fan X, Chen SC, Wang H, Sun ZY, Liao K, Chen SL, Yan Y, Kang M, Hu ZD, Chu YZ, Hu TS, Ni YX, Zou GL, Kong F, Xu YC. Antifungal susceptibilities of Candida glabrata species complex, Candida krusei, Candida parapsilosis species complex and Candida tropicalis causing invasive candidiasis in China:3 year national surveillance [J]. J Antimicrob Chemother, 2015, 70(3): 802-810.

[4] Fan X, Xiao M, Liao K, Kudinha T, Wang H, Zhang L, Hou X, Kong F, Xu YC. Notable increasing trend in azole non-susceptible Candida tropicalis causing invasive candidiasis in China [J]. Front Microbiol, 2017, 8: 464. doi: 10.3389/fmicb.2017.00464.

[5] Castanheira M, Messer SA, Rhomberg PR, Pfaller MA. Antifungal susceptibility patterns of a global collection of fungal isolates: results of the SENTRY Antifungal Surveillance Program (2013) [J]. Diagn Microbiol Infect Dis, 2016, 85(2): 200-204.

[6] Zavrel M, White TC. Medically important fungi respond to azole drugs: an update [J]. Future Microbiol, 2015, 10(8): 1355-1373.

[7] 吳金燕，易國輝，周利民，吳至成，黃憲希，郭虹.熱帶念珠菌靶位酶基因變異與氟康唑耐藥的關系 [J].中國熱帶醫(yī)學，2014，14(12)：1426-1428.

[8] Jiang C, Dong D, Yu B, Cai G, Wang X, Ji Y, Peng Y. Mechanisms of azole resistance in 52 clinical isolates of Candida tropicalis in China [J]. J Antimicrob Chemother, 2013, 68(4): 778-785.

[9] 江雨璐.熱帶假絲酵母菌對氟康唑耐藥機制的研究[D/OL].合肥：安徽醫(yī)科大學，2014.http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10366-1014320324.htm.

[10] 周永安，竇娟，張全斌，馬云霞.熱帶念珠菌臨床分離株對氟康唑耐藥分子機制的研究 [J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2011，5(21)：6329-6335.

[11] Choi JM, Won EJ, Shin JH, Kim SH, Lee WG, Kim MN, Lee K, Shin MG, Suh SP, Ryang DW, Im YJ. Resistance mechanisms and clinical features of fluconazole-nonsusceptible Candida tropicalis isolates compared with fluconazole-less-susceptible isolates [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2016, 60(6): 3653-3661.

[12] 應穎，劉發(fā)娣，熊英，莫冰，盧婷，遲利軍，龔甜，閻燕，郭曉奎，黃孝天.熱帶假絲酵母菌對氟康唑耐藥性分析 [J].中國公共衛(wèi)生，2010，26(4)：427-428.

[13] Tan J, Zhang J, Chen W, Sun Y, Wan Z, Li R, Liu W. The A395T mutation in ERG11 gene confers fluconazole resistance in Candida tropicalis causing candidemia [J]. Mycopathologia, 2015, 179(3-4): 213-218.

[14] Xisto MI, Caramalho RD, Rocha DA, Ferreira-Pereira A, Sartori B, Barreto-Bergter E, Junqueira ML, Lass-Fl?rl C, Lackner M. Pan-azole-resistant Candida tropicalis carrying homozygous erg11 mutations at position K143R: a new emerging superbug? [J]. J Antimicrob Chemother, 2017, 72(4): 988-992.

[15] Xiang MJ, Liu JY, Ni PH, Wang S, Shi C, Wei B, Ni YX, Ge HL. Erg11 mutations associated with azole resistance in clinical isolates of Candida albicans [J]. FEMS Yeast Res, 2013, 13(4): 386-393.

[16] Chau AS, Mendrick CA, Sabatelli FJ, Loebenberg D, Mcnicholas PM. Application of real-time quantitative PCR to molecular analysis of Candida albicans strains exhibiting reduced susceptibility to azoles [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(6): 2124-2131.

[17] Podust LM, Poulos TL, Waterman MR. Crystal structure of cytochrome P450 14alpha-sterol demethylase (CYP51) from Mycobacterium tuberculosis in complex with azole inhibitors [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(6): 3068-3073.

[18] Kimchi-Sarfaty C, Oh JM, Kim IW, Sauna ZE, Calcagno AM, Ambudkar SV, Gottesman MM. A “silent” polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity [J]. Science, 2007, 315(5811): 525-528.

[19] Jiang C, Ni Q, Dong D, Zhang L, Li Z, Tian Y, Peng Y. The role of UPC2 gene in azole-resistant Candida tropicalis [J]. Mycopathologia, 2016, 181(11-12): 833-838.

[20] 謝宏，竇娟，任芒格，張全斌，馬云霞，商潤萍，金柳，張景萍，王萍，周永安.熱帶假絲酵母菌外排泵基因與氟康唑耐藥性的初步研究 [J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2011，5(24)：7395-7398.

[21] Barchiesi F, Calabrese D, Sanglard D, Falconi Di Francesco L, Caselli F, Giannini D, Giacometti A, Gavaudan S, Scalise G. Experimental induction of fluconazole resistance in Candida tropicalis ATCC 750 [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2000, 44(6): 1578-1584.

[22] Vandeputte P, Larcher G, Bergès T, Renier G, Chabasse D, Bouchara JP. Mechanisms of azole resistance in a clinical isolate of Candida tropicalis [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49(11): 4608-4615.

[23] Kanani A, Zaini F, Kordbacheh P, Falahati M, Rezaie S, Daie R, Farahyar S, Safara M, Fateh R, Faghihloo E, Fattahi A, Heidari M. Identification of azole resistance markers in clinical isolates of Candida tropicalis using cDNA-AFLP method [J]. J Clin Lab Anal, 2016, 30(3): 266-272.

[24] Hwang CS, Rhie GE, Oh JH, Huh WK, Yim HS, Kang SO. Copper- and zinc-containing superoxide dismutase (Cu/ZnSOD) is required for the protection of Candida albicans against oxidative stresses and the expression of its full virulence [J]. Microbiology, 2002, 148(Pt 11): 3705-3713.

[25] Martinez L, Falson P. Multidrug resistance ATP-binding cassette membrane transporters as targets for improving oropharyngeal candidiasis treatment [J]. Adv Cell Mol Otolaryngol, 2014. doi: 10.3402/acmo.v2.23955.

. GUO Dawen, E-mail: gdw0618@aliyun.com

Progressonazoleresistance-relatedgenesinCandidatropicalis

TANG Na, GUO Dawen

DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China

Detection rate ofCandidatropicalis(C.tropicalis) is increasing in clinical practice. Azole antifungal agents are commonly used in the treatment ofC.tropicalisinfection because of their low cytotoxicity and oral administration. In China, there is a high rate of isolation of azole resistantC.tropicalis. It is necessary to understand the azole resistance mechanism ofC.tropicalis, which may provide a base for new drug targets. At present, the main mechanisms associated with resistance ofC.tropicalisto azoles are the overexpression and mutation of the target geneERG11, the overexpression and mutation ofupc2 gene encoding a transcription factor, the overexpression of efflux pump genes and other related genes. In this paper, the current progress on the latest azole resistance mechanism ofC.tropicalisis reviewed.

Candidatropicalis;ERG11; Azole resistance; Gene mutation

郭大文

2017-07-07)