高效液相色譜法測定菊芋葉和向日葵葉中綠原酸

苗 芹，葉明國，劉蘇靜，衣悅濤，夏傳海

(1.中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，山東 煙臺(tái) 264003；2.中國科學(xué)院山東綜合技術(shù)轉(zhuǎn)化中心煙臺(tái)中心， 山東 煙臺(tái) 264003；3.魯東大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；4.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

高效液相色譜法測定菊芋葉和向日葵葉中綠原酸

苗 芹1,4，葉明國2，劉蘇靜1，衣悅濤1，夏傳海3*

(1.中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所，山東 煙臺(tái) 264003；2.中國科學(xué)院山東綜合技術(shù)轉(zhuǎn)化中心煙臺(tái)中心， 山東 煙臺(tái) 264003；3.魯東大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；4.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

采用HPLC法測定菊芋葉和向日葵葉中綠原酸含量，并對收獲期菊芋葉和向日葵葉中綠原酸的積累分布進(jìn)行研究。色譜條件為：ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，檢測波長327 nm，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL·min-1，流動(dòng)相為乙腈-水(含體積分?jǐn)?shù)為0.05%的甲酸)，梯度洗脫。提取條件：甲醇-水(70∶30，體積比)回流浸提，料液比1∶25(g∶mL)，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度60 ℃。結(jié)果表明，菊芋葉和向日葵葉中的綠原酸在收獲期積累分布差異顯著，菊芋葉中綠原酸含量在10月下旬最高，為4.20%；向日葵葉中綠原酸含量在8月下旬最高，為0.47%。因此，10月下旬的菊芋葉可以作為提取綠原酸的植物原材料。

綠原酸；菊科植物；菊芋葉；向日葵葉；高效液相色譜

綠原酸(chlorogenicacid)是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸代謝途徑產(chǎn)生的一種多羥基酚酸類化合物[1-2]，從蕨類植物到高等雙子葉植物均有分布，其中含量較高的有杜仲皮、金銀花、葵花籽、咖啡豆、沙棘果等[3-4]。綠原酸具有抗菌消炎、保肝利膽、抗氧化、降血壓、抗癌、保護(hù)心腦血管、提高機(jī)體免疫力等多種功效[5-7]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健、食品、日用化工等領(lǐng)域[8]。目前，國外主要從咖啡豆中提取綠原酸[4]，但殘留的咖啡因?qū)θ梭w有害；國內(nèi)通常從杜仲皮和金銀花中提取綠原酸[6]，但杜仲皮和金銀花是重要的中藥資源。因此，尋找資源充足、價(jià)格低廉、綠原酸含量豐富的替代植物勢在必行。

綠原酸

菊芋(HelianthustuberosusL.)為菊科向日葵屬草本植物，具有耐寒、耐貧瘠、抗鹽堿、抗蟲害、繁殖能力強(qiáng)、保持水土等特性，被廣泛種植[9]。菊芋地下塊莖含有豐富的氨基酸、糖類等營養(yǎng)物質(zhì)，可熬粥、腌制，也可作為副食、調(diào)味品的加工原材料[10]。菊芋葉中含有大量的生物活性物質(zhì)，具有健胃滋補(bǔ)、輕便利尿、消腫、抗癌、預(yù)防腫瘤等功效，可治療糖尿病、高血壓、骨折腫痛等[11]。因此，菊芋是一種極具環(huán)境保護(hù)和藥用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)植物。

向日葵(HelianthusannuusL.)，又名葵花、向陽花等，與菊芋同為菊科向日葵屬草本植物[12]，具有較強(qiáng)的抗旱、耐鹽堿及適應(yīng)能力?？捎行Ц牧佳睾┩康貐^(qū)鹽堿地的土壤肥力，提高農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)[13]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[14]，向日葵的葉和花具有清熱解毒、益氣補(bǔ)腎、降血壓、預(yù)防腫瘤等功效，是一種值得開發(fā)和利用的藥用植物。

目前，國內(nèi)外對菊芋地下塊莖和葵花籽研究較多，而對菊芋葉和向日葵葉研究較少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，菊芋不同部位綠原酸含量差異顯著，其中菊芋葉中綠原酸含量(3.40%)明顯高于其它部位(莖，0.5%；花，0.25%；塊莖，0.01%)。然而，對收獲期菊芋葉中綠原酸的積累分布規(guī)律沒有深入研究。作者在此采用稀醇溶劑回流浸提法提取菊芋葉和向日葵葉中的綠原酸，采用HPLC法測定綠原酸含量，并對收獲期菊芋葉和向日葵葉中綠原酸的積累分布規(guī)律進(jìn)行研究，為尋找合適的綠原酸植物原料及其最佳采集時(shí)間提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

菊芋葉和向日葵葉均于2015年采自煙臺(tái)海岸帶研究所種植基地，其采集時(shí)間與編號如表1所示。

表1植物葉樣品采集時(shí)間與編號

Tab.1Collection time and codes of plant leaf samples

將菊芋葉和向日葵葉樣品分類存放，經(jīng)烘干、粉碎、篩分后，避光室溫(25 ℃)貯存，備用。

1.2 試劑與儀器

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(98%)、三氟乙酸，阿拉丁有限公司；色譜級甲醇、乙醇、乙腈，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；超純水，娃哈哈集團(tuán)有限公司。

分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩(40目)，浙江上虞華豐五金儀器有限公司；中草藥粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；DF-101S型磁力攪拌器，上海翔雅儀器設(shè)備有限公司； Agilent 1200型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；KQ5200E型超聲清洗器，昆山超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Agilent 1200型高效液相色譜儀：色譜柱為ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(含體積分?jǐn)?shù)為0.05%的甲酸)；梯度洗脫：0～5 min(10% 乙腈)，5～15 min(10%～15% 乙腈)，15～25 min(15%～100% 乙腈)，25～35 min(100%～10% 乙腈)；柱溫30 ℃；檢測波長327 nm；流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品13.32 mg置于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋定容，搖勻，作為綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，4 ℃冷藏保存，備用。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確量取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量于10 mL容量瓶中，加入50%甲醇稀釋定容，配制成濃度為159.84 μg·mL-1的綠原酸稀釋溶液；取適量進(jìn)一步稀釋，得到梯度濃度(μg·mL-1)分別為159.84、63.936、31.968、15.984、6.3936、3.1968、1.5984的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按色譜條件進(jìn)樣測定HPLC圖譜，計(jì)算峰面積。以峰面積(y)為縱坐標(biāo)、綠原酸濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合線性方程。

1.3.4 樣品溶液的制備

稱取粉碎過篩后的植物葉樣品約100 mg置于50 mL圓底燒瓶中，加入70%甲醇25 mL，稱量；60 ℃下恒溫加熱回流提取1.5 h，室溫放置冷卻，稱重；用70%甲醇補(bǔ)足失重，過濾；取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾；重復(fù)提取2次，得綠原酸樣品溶液。

1.3.5 綠原酸含量的測定

取適量綠原酸樣品溶液置于棕色進(jìn)樣瓶中，按色譜條件進(jìn)樣檢測，計(jì)算峰面積，根據(jù)線性方程計(jì)算樣品溶液中綠原酸濃度，按下式計(jì)算植物葉中綠原酸含量：

式中：E為植物葉中綠原酸含量，%；W為植物葉樣品的質(zhì)量，mg；c為樣品溶液中綠原酸濃度，μg·mL-1；V為樣品溶液體積，mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果如圖1所示。

圖1 綠原酸的紫外光譜

由圖1可以看出，綠原酸在327 nm處有最大吸收值。因此，確定綠原酸的檢測波長為327 nm。

2.2 綠原酸的HPLC圖譜分析(圖2)

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(a)和植物葉綠原酸樣品(b、c)的HPLC圖譜

由圖2b、2c可以看出，綠原酸樣品的HPLC圖譜的色譜基線穩(wěn)定、峰形尖銳、對稱性好，實(shí)現(xiàn)了綠原酸與其它成分基線分離，可用于綠原酸的檢測和定量分析。

2.3 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)

以峰面積(y)對濃度(x)線性回歸，得綠原酸線性方程y=28.7409x-6.0413，相關(guān)系數(shù)R2為0.9999。表明，當(dāng)綠原酸濃度在1.59～159.84 μg·mL-1范圍內(nèi)時(shí)，與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液(159.84 μg·mL-1)適量于棕色進(jìn)

圖3 綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣瓶中，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定綠原酸峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算綠原酸濃度，結(jié)果如表2所示。

表2精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2The results of precision experiment

由表2可知，RSD為0.13%。表明儀器的精密度和進(jìn)樣方法良好。

2.5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取X-2樣品5份，每份約2.5 g，按1.3.4方法制備樣品溶液，分別取適量于棕色進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣測定綠原酸峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算綠原酸濃度，結(jié)果如表3所示。

表3重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.3The results of reproducibility experiment

由表3可知，RSD為1.37%。表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取J-5樣品約0.2 g，按1.3.4方法制備樣品溶液，分別在0 h、2 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測定綠原酸峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算綠原酸濃度，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，RSD為0.52%。表明，置于棕色進(jìn)樣瓶4 ℃冷藏保存下的綠原酸樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.4The results of stability experiment

2.7 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的J-5樣品5份，每份0.1 g，于每份樣品中準(zhǔn)確加入綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.15 mg，進(jìn)樣測定綠原酸峰面積，計(jì)算綠原酸含量，結(jié)果如表5所示。

表5加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.5The results of recovery experiment

由表5可知，平均回收率為101.49%，RSD為1.51%。

2.8 植物葉樣品綠原酸含量的測定

按上述方法檢測和定量分析，得收獲期菊芋葉和向日葵葉綠原酸含量及積累分布規(guī)律如表6和圖4所示。

表6菊芋葉和向日葵葉中的綠原酸含量

Tab.6The contents of chlorogenic acid inH.tuberosus L. leaves and H.annuus L. leaves

圖4 菊芋葉(a)和向日葵葉(b)中的綠原酸積累分布

從表6和圖4a可以看出，收獲期菊芋葉中綠原酸的含量是不斷變化的。10月份菊芋葉綠原酸平均含量(3.08%)高于9月份(2.14%)和11月份(1.40%)；10月份不同時(shí)期菊芋葉綠原酸含量高低順序依次為：下旬>中旬>上旬，下旬菊芋葉中綠原酸含量達(dá)到最高(4.20%)，而后急劇下降，至11月中旬達(dá)到最低(0.51%)。通常情況下，菊芋塊莖的收獲時(shí)間為10月下旬，在此時(shí)段采摘菊芋葉提取其中的綠原酸，不僅不會(huì)影響菊芋塊莖的收益，而且還可以充分利用菊芋資源，實(shí)現(xiàn)植物的高值化利用，因此，菊芋葉的最佳采集時(shí)間為10月下旬。

從表6和圖4b可以看出，收獲期向日葵葉中綠原酸含量較低，呈先升高后降低的分布規(guī)律。8月下旬向日葵葉綠原酸含量達(dá)到最高(0.47%)，而后逐漸下降，至10月中旬葉片變黑脫落，綠原酸含量急劇下降至最低(0.11%)。向日葵雖與菊芋同為菊科植物，但向日葵葉中綠原酸含量太低，不適宜作為提取綠原酸的植物原料。

3 結(jié)論

(1)建立了檢測和定量分析菊科植物葉中綠原酸含量的HPLC方法，并對其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。通過精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，證實(shí)儀器的進(jìn)樣方法良好，基線穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)了綠原酸與其它成分的有效分離，綠原酸回收率高，精密度、重現(xiàn)性良好，樣品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定，因此可以作為菊科植物葉中綠原酸含量的檢測和定量分析方法。

(2)研究了收獲期菊科植物菊芋葉中綠原酸的積累分布規(guī)律。結(jié)果表明，菊芋葉中綠原酸含量豐富，10月下旬菊芋葉綠原酸含量最高。因此，10月下旬的菊芋葉可以作為提取綠原酸的植物原材料。

(3)研究了收獲期向日葵葉中綠原酸的積累分布規(guī)律。結(jié)果表明，8月下旬向日葵葉中綠原酸含量達(dá)到最高(0.47%)；同為菊科植物的向日葵葉中綠原酸含量比菊芋葉中綠原酸含量低。因此，向日葵葉不適宜作為提取綠原酸的植物原材料。

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Determination of Contents of Chlorogenic Acid inHelianthustuberosusL.Leaves andHelianthusannuusL.Leaves by HPLC

MIAO Qin1,4,YE Ming-guo2,LIU Su-jing1,YI Yue-tao1,XIA Chuan-hai3*

(1.YantaiInstituteofCoastalZoneResearch,ChineseAcademyofSciences,Yantai264003,China; 2.YantaiCenterforIntegratedTechnologyTransferCenter,ChineseAcademyofSciences,Yantai264003,China;3.CollegeofResourcesandEnvironmentalEngineering,LudongUniversity,Yantai264025,China; 4.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

Thecontentsofchlorogenicacid(3-CQA)inHelianthus tuberosusL.leavesandHelianthus annuusL.leavesweredeterminatedbyHPLC.Thecontentaccumulateddistributionsof3-CQAinHelianthus tuberosusL.leavesandHelianthus annuusL.leavesatharvesttimewereinvestigated.Thechromatographicconditionswereasfollows:aZORBAXExtend-C18column(4.6mm×250mm,5μm),columntemperatureof30 ℃,detectionwavelengthof327nm,injectionvolumeof10μL,flowrateof1.0mL·min-1,gradientmobilephaseofacetonitrile-water(containing0.05%formicacid).Theoptimalextractionconditionswereasfollows:solventrefluxingextractionwithmethanol-water(70∶30,volumefraction),material-liquidratioof1∶25(g∶mL),extractiontimeof1.5h,extractiontemperatureof60 ℃.Theresultsdemonstratedthatthecontentaccumulateddistributionsof3-CQAinHelianthus tuberosusL.leavesandHelianthus annuusL.leavesweresignificantdifferentatharvesttime.Thecontentof3-CQAinHelianthus tuberosusL.leavesreachedthehighestlevel(4.20%)inlateOctober.Thecontentof3-CQAinHelianthus annuusL.leavesreachedthehighestlevel(0.47%)inlateAugust.Thus,Helianthus tuberosusL.leavesinlateOctobercouldbeusedastherawmaterialforextractingchlorogenicacid.

chlorogenicacid;Compositaeplant;Helianthus tuberosusL.leaf;Helianthus annuusL.leaf;HPLC

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2011BAC02B04)，山東省科技重大專項(xiàng)(2015ZDJS03002)，山東省高等學(xué)校優(yōu)勢學(xué)科人才團(tuán)隊(duì)培育計(jì)劃“藍(lán)黃兩區(qū)濱海資源與環(huán)境團(tuán)隊(duì)”

2016-09-29

苗芹(1989-)，女，山東滕州人，碩士研究生，研究方向：植物資源高值化利用，E-mail：qmiao@yic.ac.cn；通訊作者：夏傳海，教授，E-mail:chxia_ldu@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.02.015

O 657.72 R 284.2

A

1672-5425(2017)02-0063-05

苗芹，葉明國，劉蘇靜，等.高效液相色譜法測定菊芋葉和向日葵葉中綠原酸[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(2)：63-67.