大腸桿菌半胱氨酸合成途徑強(qiáng)化對谷胱甘肽生物合成的影響

萬俊仙, 張 靜, 吳 輝, 李志敏

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室,上海 200237)

大腸桿菌半胱氨酸合成途徑強(qiáng)化對谷胱甘肽生物合成的影響

萬俊仙, 張 靜, 吳 輝, 李志敏

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室,上海 200237)

谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是一種細(xì)胞中廣泛存在的活性巰基短肽,因其具有重要的生理活性功能而得到廣泛關(guān)注。通過在EscherichiacoliMG1655中過表達(dá)3-磷酸甘油酸脫氫酶(PGDH)和絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶(SAT),并與來源于Actinobacillussuccinogenes的谷胱甘肽雙功能合成酶GshF串聯(lián)表達(dá),成功構(gòu)建了半胱氨酸合成途徑強(qiáng)化的重組菌株。搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,在含有5 g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基中,重組菌株的生長相對于原始菌降低,但其GSH的產(chǎn)量達(dá)到了0.97 mmol/L,為原始菌的1.56倍,表明通過增加GSH合成前體半胱氨酸的供應(yīng)可以顯著提高GSH的生物合成水平。

谷胱甘肽; 半胱氨酸; 基因串聯(lián)表達(dá); 搖瓶發(fā)酵

谷胱甘肽(γ-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸,GSH)是一種廣泛存在于動物、植物和微生物中的活性巰基短肽[1],因其在細(xì)胞內(nèi)多種生理代謝中起到重要作用,如抗氧化、免疫、解毒等,所以在醫(yī)藥[2]、食品添加劑、保健品[3-4]及化妝品行業(yè)得到廣泛應(yīng)用,需求量也正在逐年增加。

L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸是谷胱甘肽生物合成的3種前體氨基酸,胞內(nèi)前體氨基酸的供應(yīng)不足嚴(yán)重限制GSH的產(chǎn)量,往往需要在培養(yǎng)基中添加3種氨基酸以緩解前體不足的瓶頸,有文獻(xiàn)[5]指出,半胱氨酸和甘氨酸的外源添加能有效提高GSH的產(chǎn)量。但是半胱氨酸價格較為昂貴,而且外源添加的半胱氨酸容易被降解和氧化,導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率較低,因此提高細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸的合成是增加GSH產(chǎn)量的有效策略。

半胱氨酸的合成存在限速酶3-磷酸甘油酸脫氫酶和絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶的催化,正是由于這兩步酶催化反應(yīng)的嚴(yán)格調(diào)控,使得細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸水平一直處于較低的狀態(tài)。本研究克隆了兩個關(guān)鍵酶基因serA和cysE,并與來源于Actinobacillussuccinogenes的谷胱甘肽雙功能合成酶基因gshFas在E.coliMG1655中成功串聯(lián)表達(dá),經(jīng)搖瓶發(fā)酵驗證增加前體半胱氨酸的合成對GSH產(chǎn)量的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒E.coliMG1655，E.coliBL21,pTrc99a和pET28a由本實驗室保存,pET28a-as由本實驗室構(gòu)建,pTrc99a-serA、pTrc99a-serAdr、pTrc99a-cysE、pET28a-serA、pET28a-serAdr、pTrc99a-as-serA(serAdr)-cysE由本研究構(gòu)建。

1.1.2 試劑 DNA Marker、SDS-PAGE低相對分子質(zhì)量Marker、高保真Taq酶T4-DNA連接酶等購自Takara公司；乙酰-CoA、NADH購自Sigma公司,異丙基-β-D-硫代吡喃蘭乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素、卡那霉素等購自上海捷倍思基因技術(shù)有限公司；α-酮戊二酸、瓊脂糖購自阿拉丁試劑；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自上海生工生物工程有限公司；單片段一步克隆試劑盒購自Vazyme公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基(大腸桿菌種子培養(yǎng)):胰蛋白胨10 g/L,氯化鈉10 g/L,酵母提取物5 g/L。按需要加入氨芐青霉素(Amp)100 mg/L或卡那霉素(Kan)50 mg/L。

2×LB液體培養(yǎng)基(搖瓶培養(yǎng)):胰蛋白胨20 g/L,酵母提取物10 g/L,氯化鈉10 g/L,葡萄糖5 g/L,按需要加入氨芐青霉素100 mg/L。

LB固體培養(yǎng)基(用于重組大腸桿菌篩選):在上述液體培養(yǎng)基上加入w=2%的瓊脂,按需要加入100 mg/L Amp或50 mg/L Kan。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌的構(gòu)建 目的基因serA和cysE均通過PCR克隆得到,以E.coliMG1655菌液為模板,分別采用引物1(serA)和引物2(cysE)(表1)經(jīng)過PCR克隆,雙酶切后與質(zhì)粒pTrc99a連接并轉(zhuǎn)化E.coliMG1655,構(gòu)建圖如圖1。定點突變后的serAdr經(jīng)全基因組合成后連接至表達(dá)載體pTrc99a上,采用相同轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化E.coliMG1655。

采用重疊PCR將半胱氨酸合成途徑的關(guān)鍵基因serA(serAdr)和cysE進(jìn)行串聯(lián),串聯(lián)后的片段與經(jīng)HindⅢ單酶切并去磷酸化的雙功能酶as片段采用連接試劑盒連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliMG1655。轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒提取驗證方法見文獻(xiàn)[6]。

表1 本文中所用到的引物

圖1 質(zhì)粒pTrc99a-serA/ pTrc99a-as-serA(serAdr)-cysE的構(gòu)建圖

1.2.2 重組菌的培養(yǎng)與誘導(dǎo) 重組E.coli在含有氨芐的3 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜,然后按1%接種量轉(zhuǎn)接培養(yǎng)液至新鮮的50 mL LB液體培養(yǎng)基中同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h,加入經(jīng)過濾除菌的誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)7 h。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵 重組E.coli在3 mL的LB液體培養(yǎng)基(Amp 100 mg/L)中,37 ℃、220 r/min,培養(yǎng)過夜。按1%接種量轉(zhuǎn)接培養(yǎng)液至搖瓶培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)1.5 h,加濃度為0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo),誘導(dǎo)后的2,4,6,8,10 h分別取1 mL樣品,-20 ℃凍存,冷凍破碎離心后測定上清液中的產(chǎn)物濃度。

1.2.4 測定方法 三磷酸甘油酸脫氫酶(PGDH)和絲氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶(SAT)的酶活均采用比色法[7-8]測定,GSH的濃度采用HPLC測定[9],將-20 ℃凍存的樣品置于冰上溶解,加入等體積的20%的三氯乙醇(TCA)，在冰上放置20 min以沉淀蛋白,12 000 r/min、4 ℃離心10 min,取上清液稀釋后用0.22 μm水系微孔濾膜過濾。

2 結(jié)果和討論

2.1 絲氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶的過表達(dá)

絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶基因cysE經(jīng)電泳驗證和測序后,進(jìn)行了蛋白表達(dá)和酶活分析。重組菌E.coliMG1655/pTra99a-cysE在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),蛋白表達(dá)結(jié)果見圖2,目的蛋白SAT大小為31 kDu。酶活定義為:25 ℃時1 min內(nèi)催化形成1 μmol產(chǎn)物所需的酶量為一個酶活單位。重組菌粗酶液中SAT的酶活為0.05 U(圖3),經(jīng)克隆表達(dá)的SAT具有較高的酶活。

M—Low molecular weight protein Marker； 1—E.coli MG1655； 2，4—E.coli MG1655/pTrc99a-cysE； 3—pTrc99a plasmid

圖2 重組菌中絲氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶的蛋白表達(dá)情況

Fig.2 Expression of SAT in the recombinant

◆—E.coli MG1655/pTrc99a； ▲—E.coli MG1655/pTrc99a-cysE

圖3 SAT的酶活測定

Fig.3 Determination of SAT enzyme activity

2.2 三磷酸甘油酸脫氫酶的過表達(dá)

2.2.1 三磷酸甘油酸脫氫酶的過表達(dá) 為了積累絲氨酸并增強(qiáng)半胱氨酸的代謝通量,由大腸桿菌自身的serA和定點突變的serAdr分別構(gòu)建了兩個重組菌,其中重組菌E.coliMG1655/pTra99a-serA(serAdr)的蛋白表達(dá)見圖4,目的蛋白PGDH(PGDHdr)的大小為45 kDu,結(jié)果表明所構(gòu)建的目的蛋白可以成功表達(dá),而且serA基因的定點突變并不影響其蛋白表達(dá)水平。

M—Low molecular weight protein Marker；1—E.coli MG1655 wide type; 2—pTrc99a plasmid; 3—E.coli MG1655/pTrc99a-serA; 4—E.coli MG1655/pTrc99a-serAdr

圖4 重組菌中PGDH(PGDHdr)的蛋白表達(dá)情況

Fig.4 Expression of PGDH(PGDHdr) in the recombinant

2.2.2 定點突變對酶活的影響 由于PGDH會受到代謝途徑終產(chǎn)物絲氨酸的反饋抑制,故在該研究中將目的基因serA的344位和346位氨基酸定點突變成丙氨酸后,使得L-絲氨酸不能在調(diào)控區(qū)結(jié)合從而有效解除產(chǎn)物抑制[10]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及酶活計算公式得到PGDH及PGDHdr酶活分別為308.68 U和280.06 U。從酶活結(jié)果來看,PGDHdr的酶活相對于未突變時有所降低,這可能是因為定點突變后影響了目的蛋白與底物的結(jié)合。但是PGDHdr酶活降低并不明顯,為了進(jìn)一步驗證定點突變的影響,測定了底物L(fēng)-絲氨酸對PGDH和PGDHdr的影響(圖5)。

圖5 不同L-絲氨酸濃度對PGDH(PGDHdr)酶活的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加的L-絲氨酸濃度為0.1 mmol/L時，PGDH的酶活僅剩不到初始酶活的50%,PGDHdr的酶活沒有變化;當(dāng)L-絲氨酸濃度為10 mmol/L時,PGDH的酶活完全受到抑制,而PGDHdr的酶活僅僅減少了0.7%,幾乎完全不受影響。由實驗結(jié)果可以說明serA經(jīng)過定點突變后其產(chǎn)物反饋抑制情況可大部分解除。

2.3 GSH合成菌株的構(gòu)建及生長

采用串聯(lián)表達(dá)將serAdr(serA)和cysE與谷胱甘肽雙功能酶基因gshFas串聯(lián),三個蛋白(31,45,85 kDu)均在E.coliMG1655中成功表達(dá)(圖6)。重組菌的生長測定發(fā)現(xiàn),重組菌株4的生長速率要明顯低于原始菌(圖7)。

M—Low molecular weight protein Marker;1—E.coli MG1655; 2—E.coli MG1655/pTrc99a; 3—E.coli MG1655/pTrc99a-as-serA-cysE; 4—E.coli MG1655/pTrc99a-as-serAdr-cysE

圖7 重組E.coli生長情況的測定

E.coliMG1655/pTrc99a-as-serA-cysE和E.coliMG1655/pTrc99a-as-serAdr-cysE的比生長速率為0.32 h-1和0.30 h-1,僅為原始菌的58%?？赡芤驗楸磉_(dá)質(zhì)粒pTrc99a為高拷貝質(zhì)粒,PGDH(PGDHdr)和SAT蛋白的表達(dá)量過多導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)需要消耗更多的前體和能量用于蛋白合成,增加了細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān),導(dǎo)致其生長減緩。對于過表達(dá)菌株來說平衡菌體生長和蛋白表達(dá)是增強(qiáng)前體合成途徑的一個關(guān)鍵因素。

2.4 搖瓶培養(yǎng)合成谷胱甘肽

為了驗證增強(qiáng)半胱氨酸合成途徑對GSH產(chǎn)量的影響,將重組菌在含有5 g/L葡萄糖的2×LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)和誘導(dǎo),重組菌搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)GSH的結(jié)果如圖8所示，GSH的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸增加,其中E.coliMG1655/pTrc99a-as-serAdr-cysE的初速率明顯提高。在發(fā)酵8 h時E.coliMG1655/pTrc99a-as達(dá)到最高產(chǎn)量(0.62±0.03)mmol/L,而E.coliMG1655/pTrc99a-as-serA-cysE,E.coliMG1655/pTrc99a-as-serAdr-cysE中最終GSH產(chǎn)量都為(0.97±0.01)mmol/L,為原始菌的1.56倍。過表達(dá)半胱氨酸合成途徑的關(guān)鍵基因,增強(qiáng)半胱氨酸的合成可以明顯提高細(xì)胞合成GSH的能力,這是因為增加了前體的供應(yīng),而與GSH合成酶的串聯(lián)表達(dá)使得更多的代謝流流向了GSH合成,GSH的產(chǎn)量進(jìn)一步提高。在不添加前體的搖瓶發(fā)酵中達(dá)到了0.97 mmol/L的產(chǎn)量,有效降低了生產(chǎn)成本。同時也發(fā)現(xiàn)盡管serA基因經(jīng)過定點突變后GSH合成的初速率明顯加快,但最終的產(chǎn)量并沒有增加,這可能是因為在不添加前體的搖瓶發(fā)酵時細(xì)胞內(nèi)的L-絲氨酸積累并不多,對PGDH的抑制效果不明顯。所以serA的定點突變沒有顯著提高GSH的產(chǎn)量。

圖8 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)GSH過程曲線圖

3 結(jié) 論

本實驗通過在EscherichiacoliMG1655中過表達(dá)3-磷酸甘油酸脫氫酶(PGDH)和絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶(SAT),并與谷胱甘肽雙功能合成酶GshF串聯(lián)表達(dá),構(gòu)建了半胱氨酸合成途徑強(qiáng)化的重組菌株。經(jīng)過酶活檢測,過表達(dá)的PGDH以及SAT的酶活分別為308.68 U和 0.05 U;為了解除代謝途徑中L-絲氨酸對PGDH的反饋抑制,對目的基因serA進(jìn)行定點突變,PGDHdr的酶活檢測為280.06 U,實驗結(jié)果表明在不影響目的蛋白表達(dá)的情況下有效地解除了反饋抑制,并顯著提高了GSH的產(chǎn)量;但是該表達(dá)重組菌株生長速率受限,僅為原始菌的58%,因此要進(jìn)一步探究菌體生長以及蛋白表達(dá)的平衡。最終搖瓶發(fā)酵結(jié)果顯示,在含有5 g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基中,GSH產(chǎn)量達(dá)到了0.97 mmol/L,為原始菌的1.56倍,表明增加 GSH前體半胱氨酸的供應(yīng)能有效提高 GSH生物合成水平。

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Effect of Strengthening the Cysteine Synthetic Pathway on Glutathione Biosynthesis inEscherichiacoli

WAN Jun-xian, ZHANG Jing, WU Hui, LI Zhi-min

(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

Glutathione(GSH) is one of the thiol short peptides,which widely exists in cells.It attracts attention because of its important physiological activity.We strengthen the cysteine synthesis to improve the GSH synthesis inEscherichiacoli.The key enzymes,3-glyceric acid phosphate dehydrogenase(PGDH) and serine acetyltransferase,were overexpressed inE.coliMG1655 and then the GSH synthetasegshFaswasco-overexpressed with the two enzymes.The results of fermentation in the flasks with the recombinant strains showed that the growth was decreased in the recombinants and the production of GSH reached 0.97 mmol/L,which was 1.56 fold that of original.The level of GSH biosynthesis can be improved significantly by increasing the supply of precursor cysteine.

Glutathione;L-cysteine; tandem gene expression; shaking fermentation

1006-3080(2017)01-0061-05

10.14135/j.cnki.1006-3080.2017.01.010

2016-05-11

國家自然科學(xué)青年基金項目(21406065)；上海市科委產(chǎn)學(xué)研醫(yī)合作項目(13DZ1930200)；生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室開放課題資助項目(2060204)

萬俊仙(1992-),女,湖北人,碩士生,主要從事基因工程菌生產(chǎn)谷胱甘肽的研究。

李志敏,E-mail:lizm@ecust.edu.cn

TQ920.1；Q78

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