缺氧對細(xì)胞膜ABCA1降解的影響及其機制研究*

莫顯剛，洪偉，王蘭，張莉，劉大男，代陸軍，蔣金，郜雙林

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 綜合病房，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽 550004）

缺氧對細(xì)胞膜ABCA1降解的影響及其機制研究*

莫顯剛1，洪偉2，王蘭1，張莉1，劉大男3，代陸軍4，蔣金4，郜雙林2

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 綜合病房，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽 550004）

D O I：10.3969/j.i s s n.1005-8982.2017.03.003

目的探討缺氧對細(xì)胞膜三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ABC A1）降解的影響及其與鈣蛋白酶的相關(guān)機制。方法肝X受體激動劑TO-901317刺激R AW 264.7細(xì)胞24h，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測ABC A1 m R N A表達水平。生物素標(biāo)記法提取細(xì)胞膜蛋白，W es t ern bl ot檢測細(xì)胞膜ABC A1蛋白水平表達。W es t ern bl ot檢測在放線菌酮存在或不存在條件下，TO-901317干預(yù)的R AW 264.7細(xì)胞經(jīng)過12 h缺氧（1%氧氣O2）處理后細(xì)胞膜ABC A1蛋白水平，Suc-LLVY-氨基蟲熒光素法檢測缺氧細(xì)胞內(nèi)鈣蛋白酶活性。R AW 264.7細(xì)胞給予鈣蛋白酶抑制劑ALLN干預(yù)，檢測細(xì)胞膜ABC A1蛋白表達及鈣蛋白酶活性。結(jié)果TO-901317上調(diào)ABC A1 m R N A及細(xì)胞膜蛋白水平表達。無論放線菌酮存在或不存在情況下，缺氧均能降低細(xì)胞膜ABC A1蛋白水平，升高鈣蛋白酶活性。鈣蛋白酶抑制劑ALLN能部分逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞膜ABC A1蛋白水平降低。結(jié)論缺氧可能通過增加鈣蛋白酶活性，從而加速細(xì)胞膜ABC A1蛋白降解。

三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1；缺氧；鈣蛋白酶；放線菌酮

三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體 A1（adenosi ne t ri phosphat e bi ndi ng casset t e t ransport er A1，ABCA1）將細(xì)胞內(nèi)膽固醇排出，形成新生性高密度脂蛋白，是抗動脈粥樣硬化的重要膜蛋白[1]。ABCA1基因可被肝X受體（l i ver x recept or，LXR）激動劑轉(zhuǎn)錄激活[2]，ABCA1蛋白也可被鈣蛋白酶介導(dǎo)蛋白降解[3]。動脈粥樣硬化斑塊中缺氧普遍存在[4-5]，而且缺氧顯著降低巨噬細(xì)胞膽固醇外排，延長缺氧時間，促進ABCA1蛋白水平下調(diào)[4]，但是ABCA1基因啟動子還存在缺氧反應(yīng)元件，亦可被缺氧轉(zhuǎn)錄增強[6]。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子可增強鈣蛋白酶表達及活性[7]。故推測缺氧可能參與鈣蛋白酶介導(dǎo)細(xì)胞膜ABCA1降解，但鮮見相關(guān)文獻報道。本研究上調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)源性ABCA1蛋白表達，抑制新蛋白生成，探討缺氧對細(xì)胞膜ABCA1蛋白水平的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

三氣培養(yǎng)箱（美國Therm o公司），超聲破碎儀（KQ-500D A，昆山市超聲儀器有限公司），Beckm an 21R型冷凍離心機（美國Beckm an公司），ABI實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quant i t at i ve real-t i m e pol ym erase chai n react i on，qRT-PCR）儀（9300型，美國Therm o公司），W est ern bl ot電泳儀（164-5051，美國Bi o-Rad公司），Synergy H T多檢測酶標(biāo)儀（美國BIOTEK公司）。RAW 264.7細(xì)胞購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，鈣蛋白酶抑制劑（N-acet yl-Leu-Leu-Norl euci nal，ALLN）（美國Si gm a公司，貨號：208719），ABCA1抗體（英國Abcam公司，貨號：ab18180），β肌動蛋白抗體購于（英國Abcam公司，貨號：ab8227），鈣蛋白酶活性檢測試劑盒（美國Prom ega公司，貨號：G8501），LXR受體激動劑 TO-901317（美國Caym an公司，貨號：71810），放線菌酮（美國Si gm a公司，貨號：C7698），細(xì)胞表面蛋白提取試劑盒（美國Pi erce公司，貨號：89881）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組

RA264.7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于達爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dul becco's m i ni m um essent i al m edi um，DM EM）/ F12，取生長期細(xì)胞種植6孔板或75 cm2培養(yǎng)瓶，實驗分為3步：①給予或不給予LXR受體激動劑TO-901317（1μm ol/L），分為空白對照組、二甲基亞砜（di m et hyl sul phoxi de，DM SO）組及TO-901317組，檢測干預(yù)24 h前后ABCA1 m RNA及細(xì)胞膜蛋白水平；②缺氧對細(xì)胞膜ABCA1蛋白水平影響。取LXR受體激動劑干預(yù)后24 h細(xì)胞，放線菌酮（50 m m ol/l）或缺氧（1%氧氣O2）共孵育12 h，分為常氧組、缺氧組、放線菌酮組+常氧組、放線菌酮+缺氧組，細(xì)胞生物素標(biāo)記法提取膜蛋白，檢測ABCA1含量，熒光法檢測鈣蛋白酶活性；③鈣蛋白酶抑制劑ALLN（10μm ol/L）對ABCA1表達影響，分為常氧組、缺氧組、缺氧+ALLN組、缺氧+放線菌酮組、缺氧+放線菌酮+ALLN組，檢測ABCA1含量及鈣蛋白酶活性。

1.3 實驗方法

1.3.1 qR T-PC R 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR 25μl反應(yīng)體系包括SYBR Green qRTPCR反應(yīng)混合物12.5μl、cDNA模板1μl、NH E-1、β肌動蛋白正反向引物各0.5μl。ABCA1正向引物：5'-GGACATGCACAAGGTCCTGA-3'，反向引物：5'-CAGAAAATCCTGGAGCTTCAAA-3'；β 肌動蛋白正向引物：5'-GCAGTTGGTTGGAGCAAACAT-3'，反向引物：5'-AGGGACTTCCTGTAACCACT-3'。聚合酶鏈反應(yīng)擴增條件：95℃預(yù)變性10 m i n；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃拉伸30 s，共35個循環(huán)。讀取樣本中ABCA1和β肌動蛋白的CT值。β肌動蛋白作為內(nèi)參照，目的基因相對表達量采用2-△△CT法進行計算。

1.3.2 生物素標(biāo)記膜蛋白提取 嚴(yán)格按細(xì)胞表面蛋白提取試劑盒（美國Pi erce公司）說明書提取膜蛋白。培養(yǎng)細(xì)胞冷磷酸鹽緩沖溶液沖洗2次，加入Sul f o-NH S-SS-Bi ot i n溶液10 m l，4℃下振蕩孵育30 m i n，終止反應(yīng)，刮取細(xì)胞加入50 m l離心管中，500 r/m i n離心3 m i n，去上清液。加入含蛋白抑制劑的細(xì)胞裂解液于沉淀中，轉(zhuǎn)移至1.5 m l離心管，超聲破碎5次，冰上繼續(xù)裂解30 m i n，4℃、10 444 r/m i n離心2 m i n，上清轉(zhuǎn)移至新離心管中。加入含蛋白抑制劑的細(xì)胞裂解液于1.5 m l離心管中。輕輕插入吸附柱，向柱中加入500μl Neut r Avi di n瓊脂糖珠，加入上述生物素化上清，震蕩室溫孵育60 m i n，加入含蛋白抑制劑洗滌液離心。50 m m ol/L二硫蘇糖醇的聚丙烯酰胺凝膠上樣緩沖液加入吸附柱，震蕩孵育60 m i n，吸附柱3 302 r/m i n離心2 m i n，收集含樣本的聚丙烯酰胺凝膠上樣緩沖液。

1.3.3 W es t ern bl ot檢測細(xì)胞膜ABC A1蛋白 等量蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉后孵育Ⅰ抗（抗ABCA1單抗，1∶1 000）過夜，孵育Ⅱ抗，增強化學(xué)發(fā)光顯色。β肌動蛋白作為內(nèi)參照。

1.3.4 鈣蛋白酶活性檢測 按鈣蛋白酶活性檢測試劑盒說明書操作步驟進行檢測。已處理RAW 264.7細(xì)胞中加入無鈣裂解液，取50μl蛋白上清液用來檢測鈣蛋白酶活性。每個樣品分別加入含鈣或無鈣的緩沖液，再加入特異性熒光底物Suc-LLVY-氨基蟲熒光素，37℃反應(yīng)4 h，在Synergy H T多檢測酶標(biāo)儀讀數(shù)（激發(fā)/發(fā)射波長為355/460 nm），其活性用含鈣樣品的讀數(shù)減無鈣樣品的讀數(shù)計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較用單因素方差分析，若方差齊組間兩兩比較用LSD-t檢驗，所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LXR受體激動劑TO-901317對細(xì)胞ABCA1表達的影響

LXR受體激動劑TO-901317干預(yù)24 h，qRTPCR檢測各組m RNA水平，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=41.603，P=0.001）。DM SO組與空白對照組ABCA1 m RNA水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= -0.166，P=0.595）；TO-901317組與DSM O組ABCA1 m RNA水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.343，P= 0.033），提示TO-901317組的m RNA水平高于DSM O組。W est ern bl ot檢測結(jié)果顯示，各組細(xì)胞膜ABCA1蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 23.340，P=0.003）。DM SO組與空白對照組細(xì)胞膜ABCA1蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.250，P=0.896），而TO-901317組細(xì)胞膜ABCA1蛋白水平與DSM O組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.672，P= 0.044），提示TO-901317組細(xì)胞膜ABCA1水平高于DSM O組。故后續(xù)實驗基于TO-901317干預(yù)后細(xì)胞進行ABCA1降解分析。見表1和圖1。

表1 LXR受體激動劑對ABCA1表達的影響 （n=3±s）

表1 LXR受體激動劑對ABCA1表達的影響 （n=3±s）

注：?與DM SO組比較，P＜0.05

組別ABCA1蛋白空白對照組 1.000±0.118 0.152±0.036 DM SO組 1.110±0.082 0.171±0.033 TO-901317組 8.671±1.407? 0.840±0.157?ABCA1 m RNA

圖1 TO-9013177對RAW264.7細(xì)胞膜ABCA1蛋白的影響

2.2 缺氧及放線菌酮對細(xì)胞膜ABCA1蛋白及鈣蛋白酶活性的影響

TO-901317干預(yù)后細(xì)胞給予放線菌酮或缺氧干預(yù)12 h，各組細(xì)胞膜ABCA1蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.809，P=0.013）。常氧+放線菌酮組與常氧組細(xì)胞膜ABCA1蛋白水平比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.993，P=0.348）；缺氧+放線菌酮組與缺氧組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.551，P=0.007），缺氧+放線菌組的細(xì)胞膜ABCA1蛋白水平低于缺氧組；更重要是，缺氧組與常氧組、缺氧+放線菌酮組與常氧+放線菌酮組分別進行比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（t=-8.797和-11.355，P=0.000），提示無論是否給予放線菌酮干預(yù)，缺氧條件下細(xì)胞膜ABCA1蛋白水平均低于常氧組。進而鈣蛋白酶活性檢測顯示，各組鈣蛋白酶活性比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=132.619，P=0.000）。常氧+放線菌酮組與常氧組、缺氧+放線菌酮組與常氧+放線菌酮組分別進行比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= 0.603和2.104，P=0.563和0.068），提示無論常氧還是缺氧，放線菌酮不影響鈣蛋白酶活性；但缺氧組與常氧組、缺氧+放線菌酮組與常氧+放線菌酮組分別進行比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=24.342和22.239，P=0.000），缺氧組、缺氧+放線菌酮組鈣蛋白酶活性分別高于常氧組、常氧+放線菌酮組，提示缺氧增強鈣蛋白酶活性。見表2和圖2。

2.3 ALLN對細(xì)胞膜ABCA1蛋白及鈣蛋白酶活性的影響

給予ALLN干預(yù)后，W est ern bl ot檢測ABCA1蛋白表達，各組蛋白水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=64.604，P=0.000）。缺氧組與常氧組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-11.182，P=0.000），缺氧組的細(xì)胞膜ABCA1蛋白水平低于常氧組；缺氧+ALLN組與缺氧組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.701，P=0.000），缺氧+ALLN組的細(xì)胞膜ABCA1蛋白水平高于缺氧組；缺氧+放線菌酮+ALLN組與缺氧+放線菌酮組比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.000，P=0.000），缺氧+放線菌酮+ALLN組ABCA1蛋白水平高于缺氧+放線菌酮組。上述結(jié)果提示，鈣蛋白酶抑制劑ALLN可逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞膜ABCA1蛋白水平降低。鈣蛋白酶活性檢測結(jié)果顯示，各組鈣蛋白酶活性比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=576.793，P=0.000）。缺氧+ALLN組與缺氧組、缺氧+放線菌酮+ALLN組與缺氧+放線菌酮組分別進行比較，經(jīng)LSD-t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-29.783和-28.898，P=0.000），缺氧+ALLN組、缺氧+放線菌酮+ALLN組的鈣蛋白酶活性分別低于缺氧組、缺氧+放線菌酮組，提示ALLN能抑制鈣蛋白酶活性。見表3和圖3。

表2 缺氧及放線菌酮對ABCA1蛋白及鈣蛋白酶活性的影響 （n=3±s）

表2 缺氧及放線菌酮對ABCA1蛋白及鈣蛋白酶活性的影響 （n=3±s）

注：1）與常氧組比較，P＜0.05；2）與缺氧組比較，P＜0.05；3）與常氧+放線菌酮組比較，P＜0.05

組別常氧組ABCA1蛋白0.762±0.095鈣蛋白酶活性/% 100.000±7.022缺氧組 0.313±0.0351） 326.953±17.2891）常氧+放線菌酮組 0.711±0.070 94.233±9.645缺氧+放線菌酮組 0.132±0.0181）2）3） 306.837±10.3521）2）3）

圖2 缺氧及放線菌酮對RAW264.7細(xì)胞膜ABCA1蛋白的影響

表3 ALLN對ABCA1蛋白及鈣蛋白酶活性的影響（n=3±s）

表3 ALLN對ABCA1蛋白及鈣蛋白酶活性的影響（n=3±s）

注：1）與常氧組比較，P＜0.05；2）與缺氧組比較，P＜0.05；3）與缺氧+放線菌酮組比較，P＜0.05

組別常氧組缺氧組ABCA1蛋白1.453±0.170 0.495±0.0731）鈣蛋白酶活性/% 100.000±7.022 326.953±17.2891）缺氧+ALLN組 1.069±0.1092） 12.683±9.2802）缺氧+放線菌酮組 0.241±0.0272） 318.783±18.238缺氧+放線菌酮+ALLN組 0.841±0.0773） 13.847±8.2533）

圖3 ALLN對細(xì)胞膜ABCA1蛋白的影響

3 討論

缺氧導(dǎo)致細(xì)胞ABCA1蛋白水平降低及膽固醇外流異常[4]。本研究從ABCA1降解新角度探討缺氧細(xì)胞ABCA1蛋白水平下降機制，結(jié)果顯示，缺氧顯著升高鈣蛋白酶活性，降低ABCA1蛋白水平，這些效應(yīng)能鈣蛋白酶抑制劑部分逆轉(zhuǎn)，提示鈣蛋白酶介導(dǎo)ABCA1降解是缺氧誘導(dǎo)ABCA1蛋白水平降低的重要途徑。

缺氧是機體重要的生理及病理生理過程。缺氧誘導(dǎo)因子積聚是細(xì)胞對缺氧的重要反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可以升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，同時升高鈣蛋白酶活性[7]，鈣蛋白酶被鈣離子激活是廣為接受的觀點，故缺氧鈣蛋白酶活性升高部分原因是鈣離子升高所刺激。新近研究表明，缺氧時鈣蛋白酶蛋白表達上調(diào)，可能是缺氧誘導(dǎo)鈣蛋白酶活性升高的重要原因[8]。缺氧誘導(dǎo)鈣蛋白酶活性升高，不僅僅是影響細(xì)胞膜上ABCA1蛋白降解，還可能降解其他蛋白，從而參與各種細(xì)胞活動及功能[8]。

本研究鈣蛋白酶活性檢測提示，缺氧上調(diào)鈣蛋白酶活性，同時ABCA1蛋白水平降低，而且給予鈣蛋白酶抑制劑，ABCA1蛋白水平回升。缺氧誘導(dǎo)ABCA1降解，可能至少包括鈣蛋白酶介導(dǎo)ABCA1降解。鈣蛋白酶介導(dǎo)ABCA1降解機制明確，但是其意義有待進一步明確，本研究發(fā)現(xiàn)可將缺氧誘與鈣蛋白酶介導(dǎo)ABCA1降解聯(lián)系起來。除缺氧外，還有其他重要因素或因子能升高鈣蛋白酶[9-10]，對進一步明確與鈣蛋白酶相關(guān)ABCA1降解具有一定借鑒意義。

本實驗主要研究缺氧對細(xì)胞膜上ABCA1表達的影響。筆者發(fā)現(xiàn)，缺氧下調(diào)細(xì)胞膜上ABCA1蛋白水平，該蛋白水平降低與既往研究ABCA1基因啟動子區(qū)域擁有缺氧反應(yīng)元件，并與H IF-1β相對應(yīng)的ABCA1量升高不一致[6]。該m RNA水平高于膜蛋白水平的差異，可能是歸因于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。首先，缺氧可能降低m RNA穩(wěn)定性[11]。要形成活性膜蛋白需要從高爾基體轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜[12]，該過程可能受到缺氧調(diào)節(jié)。其次，膜蛋白更新，膜蛋白不斷被降解。缺氧能否影響ABCA1 m RNA穩(wěn)定性有待進一步研究。但是本研究利用LXR激動劑上調(diào)ABCA1后給予缺氧，并給予放線菌酮抑制新生蛋白產(chǎn)生，蛋白變化主要反映出ABCA1降解，表明缺氧加速ABCA1降解。ABCA1活性形式主要是細(xì)胞膜上ABCA1，而且有文獻研究表明，鈣蛋白酶在細(xì)胞膜附近被激活，可通過細(xì)胞骨架蛋白Ezri n參與進行[9]。本研究可在一定程度上解釋缺氧時間短，ABCA1總蛋白無明顯變化而膽固醇外流異常，而且在細(xì)胞膜ABCA1表達下降[4]。

本研究明確缺氧經(jīng)鈣蛋白酶途徑促進ABCA1降解，但是缺氧如何促進鈣蛋白酶介導(dǎo)ABCA1降解，以及如何調(diào)控等更詳盡機制有待進一步研究。鑒于ABCA1在抗動脈粥樣硬化中的獨特的重要作用[13]，本研究從ABCA1降解新角度，為深入探討缺氧參與動脈粥樣硬化新機制提供新思路。

[1]ORAM J F,LAW N R M,GARVIN M R,et al.ABCA1 i s t he cAM P-i nduci bl e apol i poprot ei n recept or t hat m edi at es chol est erol secret i on f rom m acrophages[J].J Bi ol Chem,2000,275：34508-34511.

[2]CH AW LA A,BOISVERT W A,LEE C H,et al.A PPAR gamm a-LXR-ABCA1 pat hway i n m acrophages i s i nvol ved i n chol est erol ef f l ux and at herogenesi s[J].M ol Cel l,2001,7：161-171.

[3]W ANG N,CH EN W,LINSEL-NITSCH KE P,et al.A PEST sequence i n ABCA1 regul at es degradat i on by cal pai n prot ease and st abi l i zat i on of ABCA1 by apoA-I[J].J Cl i n Invest,2003,111：99-107.

[4]PARATH ATH S,M ICK S L,FEIG JE,et al.H ypoxi a i s present i n m uri ne at heroscl erot i c pl aques and has m ul t i pl e adverse ef f ect s on m acrophage l i pi d m et abol i sm[J].Ci rc Res,2011,109：1141-1152.

[5]PEDERSEN S F,GRABE M,H AG A M,et al.(18)F-FDG i m agi ng of hum an at heroscl erot i c carot i d pl aques ref l ect s gene expressi on of t he key hypoxi a m arker H IF-1α[J].Am J Nucl M ed M ol Im agi ng,2013,3：384-392.

[6]UGOCSAI P,H OH ENSTATT A,PARAGH G,et al.H IF-1bet a det erm i nes ABCA1 expressi on under hypoxi a i n hum an m acrophages[J].Int J Bi ochem Cel l Bi ol,2010,42：241-252.

[7]M O X G,CH EN Q W,LI X S,et al.Suppressi on of NH E1 by sm al l i nt erf eri ng RNA i nhi bi t s H IF-1α-i nduced angi ogenesi s i n vi t ro vi a m odul at i on of cal pai n act i vi t y[J].M i crovasc Res,2011, 81：160-168.

[8]CUI W,ZH OU J,DEH NE N,et al.H ypoxi a i nduces cal pai n act i vi t y and degrades SM AD2 t o at t enuat e TGFβ si gnal i ng i n m acrophages[J].Cel l Bi osci,2015,5：36.

[9]YOUN JY,W ANG T,CAI H.An ezri n/cal pai n/PI3K/AM PK/eNOSs 1179 si gnal i ng cascade m edi at i ng VEGF-dependent endot hel i al ni t ri c oxi de product i on[J].Ci rc Res,2009,104：50-59

[10]苑聰,吳潔,姜志勝,等.胰島素可通過cal pai n和prot easom e途徑促進3T3-L1脂肪細(xì)胞三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1的降解[J].中華心血管病雜志,2015,43：141-145.

[11]H OSOGAI N,FUKUH ARA A,OSH IM A K,et al.Adi pose t i ssue hypoxi a i n obesi t y and i t s i m pact on adi pocyt oki ne dysregul at i on[J].Di abet es,2007,56：901-911.

[12]NEUFELD E B,REM ALEY A T,DEM OSKY S J,et al.Cel l ul ar l ocal i zat i on and t raf f i cki ng of t he hum an abca1 t ransport er[J].J Bi ol Chem,2001,276：27584-27590.

[13]DEAN M,H AM ON Y,CH IM INI G.The hum an ATP-bi ndi ng casset t e(ABC)t ransport er superf am i l y[J].J Li pi d Res,2001,42：1007-1017.

（童穎丹 編輯）

Hypoxia enhances degradation of plasma membrane ABCA1 via increased calpain activity*

Xian-gang Mo1,Wei Hong2,Lan Wang1,Li Zhang1,Da-nan Liu3, Lu-jun Dai4,Jin Jiang4,Shuang-lin Gao2
(1.Comprehensive Ward,the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang, Guizhou 550004,China;2.Key Laboratory of Medical Molecular Biology,Guizhou Medical University,Guiyang,Guizhou 550004,China;3.Department of Cardiology,4.Department of Pathology,the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University,Guiyang, Guizhou 550004,China)

ObjectiveTo investigate the effect of hypoxia on the degradation of plasma membrane ATP binding cassette transporter A1 (ABCA1)and its calpain-related mechanism.MethodsqRT-PCR was used to detect ABCA1 mRNA level in RAW264.7 cells stimulated by liver X receptor agonist TO-901317 for 24 h. Plasma membrane protein was extracted by the biotin labeling method of surface proteins,and membrane ABCA1 protein level was determined by Western blot.Western blot was applied to detect the plasma membrane ABCA1 protein level from TO-901317-treated RAW264.7 cells after 12-h hypoxia (1%O2)treatment in the presence or absence of Cycloheximide.Furthermore,the calpain activity in the hypoxic cells was assayed by the method of Suc-LLVY-aminoluciferin.Finally,plasma membrane ABCA1 protein and calpain activity were measured in the RAW264.7 cells after intervention with calpain inhibitor ALLN.ResultsLXR agonist TO-901317 up-regulatedABCA1mRNA and membrane protein levels.Hypoxia reduced plasma membrane ABCA1 protein in the RAW264.7 cells and increased the calpain activity in the absence or presence of Cyclohex－imide.Calpain inhibitor ALLN,in part,reversed the decrease of plasma membrane ABCA1 induced by hypoxia.ConclusionsHypoxia might accelerate the degradation of plasma membrane ABCA1 via enhancement of calpain activity.

ATP binding cassette transporter A1;hypoxia;calpain;Cycloheximide

1005-8982（2017）03-0013-05

R 543.5；R 364

A

2016-02-24

國家自然科學(xué)基金（No：31260250）