慢性低氧暴露對血小板活化及其分泌的炎性因子水平的影響※

尚春香，烏仁塔娜，南星梅，格日力

(青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心)

對低氧信號通路的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，低氧與炎癥密切相關(guān)，低氧可以誘導(dǎo)炎癥發(fā)生，同時炎癥可以加重缺氧。近年來的研究顯示，低氧可以通過誘導(dǎo)血小板活化參與一些疾病的發(fā)生和發(fā)展，但目前尚不明確低氧誘導(dǎo)的炎性疾病是否與血小板相關(guān)。本研究擬通過觀察慢性低氧暴露對血小板活化及其分泌的炎性因子水平的影響，探討血小板分泌的炎性因子是否與高海拔低氧誘導(dǎo)的炎癥損傷相關(guān)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物及分組

將60只清潔級雄性SD大鼠(180～200g，6周齡，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)隨機(jī)平均分為三組，平原組(北京，海拔50m)，中度海拔組(西寧，海拔2260m)，特高海拔組(低壓氧艙模擬，海拔5000m)。中度海拔組和特高海拔組大鼠從北京空運(yùn)至西寧的當(dāng)天分別放置在動物飼養(yǎng)中心和低壓氧艙室(模擬海拔5000m)，兩組大鼠飼養(yǎng)30天后，所有大鼠稱重后在氯胺酮麻醉狀態(tài)下從腹主動脈取血行血氣分析、全血細(xì)胞計數(shù)檢測；分離富血小板血漿(PRP)和制備血小板懸液。平原組大鼠在北京大學(xué)生命科學(xué)院生理實驗室稱重麻醉后從腹主動脈取血行血氣分析、全血細(xì)胞計數(shù)檢測；分離PRP。

1.1.2 主要試劑與儀器

低壓氧艙室(貴州風(fēng)雷航空機(jī)械有限公司，型號：DYC-3000，體積：8m×3m×3m)，BC-2300全自動血細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子有限公司)，全自動酶標(biāo)酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀(FACScan型美國Dickinson公司)。PE-CD62p抗體(Bioledgend)、PerCP-CD61(Novus)、ADP(Sigma)、p-select檢測ELISA試劑盒，CD40檢測ELISA試劑盒，CD40L檢測ELISA試劑盒，PAF檢測ELISA試劑盒，HIF-1a檢測ELISA試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)。

1.2 實驗方法

1.2.1 血氣和全血細(xì)胞分析

三組大鼠分別稱重后，在氯胺酮麻醉狀態(tài)下用動脈血氣針從腹主動脈抽取2 mL動脈血立即行血氣分析，之后用EDTA抗凝管采集2 mL動脈血在1 h內(nèi)完成全血細(xì)胞分析。

1.2.2 血小板相關(guān)炎性因子測定

1.2.3 血小板懸液制備

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測

血小板表面CD62P的陽性率：Falcon試管中加入PE-CD62P抗體和PerCP-CD61抗體各20 μL，然后加入血小板懸液100 μL和血小板激動劑二磷酸腺苷(ADP，10μmol/L)避光孵育15 min，之后加入1 mL PBS溶液洗滌、離心(1500r/min)5 min，棄去上清液，加入500 μL PBS，半小時內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測，在CD61 vs SSC 點圖中設(shè)門，找到 CD61 陽性的血小板群門，門內(nèi)收集10 000個細(xì)胞，結(jié)果以血小板CD62P陽性百分率表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠一般狀態(tài)觀察

平原組和中海拔組大鼠進(jìn)食和活動正常，狀態(tài)良好，高海拔組大鼠進(jìn)入低壓氧艙后進(jìn)食和活動量減少，體重增長速度與其他兩組相比有所下降，但統(tǒng)計學(xué)無差異。

2.2 三組不同海拔大鼠血細(xì)胞分析和血氣分析

三組不同海拔大鼠中性粒細(xì)胞計數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異，特高海拔組和中海拔組大鼠的RBC、Hb、HCT、MPV和PDW均高于平原組(P<0.05)，且計數(shù)隨著海拔高度的升高而升高，特高海拔組和中海拔組與平原組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。PLT計數(shù)隨著海拔高度的升高而下降，特高海拔組和中海拔組與平原組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。血氣分析結(jié)果顯示，三組大鼠的PaO2和Sa02值隨著海拔高度升高而下降，特高海拔組和中海拔組大鼠的PaO2和Sa02值與平原組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1。

Table 1 Total blood cell count and arterial blood gas analysis among 3 groups of different altitude rats(±s)

2.3 平原組和特高海拔組大鼠PRP中血小板分泌的炎性因子檢測

特高海拔大鼠PAF、p-select、CD40、CD40L和HIF-1a的表達(dá)水平均高于平原組，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2。

Table 2 The express of HIF-1a and platelet derived inflammation factor in 2 groups of different altitude rats′ PRP(±s)

2.4 中海拔組和特高海拔組大鼠血小板活性比較

特高海拔大鼠血小板CD62P陽性率在給予激活劑ADP之前(14.96±0.95VS 7.75±1.29)和之后(10.31±1.38VS 20.25±2.39)都高于中海拔組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

Figure1TheexpressionpositiverateofCD62Pbetween2groupsofdifferentaltituderats

3 討論

高原低氧環(huán)境對人體多系統(tǒng)多臟器造成損傷致各種高原性疾病，包括心血管、中樞神經(jīng)和呼吸系統(tǒng)的疾病，近年來的研究發(fā)現(xiàn)高原低氧環(huán)境還可以引起急慢性炎癥反應(yīng)。劉厚東等[1]的研究顯示，急進(jìn)高原人群由于低氧暴露后可以引起白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞增加，血液中IL-1、IL-6、TNF-a和PAF等炎性介質(zhì)含量增加，而機(jī)體這種炎性改變可以導(dǎo)致胃腸道粘膜屏障的損傷，出現(xiàn)胃黏膜出血、糜爛和潰瘍形成。而李木成等[2]的研究顯示，急進(jìn)高原發(fā)生高原肺水腫的患者，體內(nèi)細(xì)胞由于嚴(yán)重缺氧發(fā)生變性產(chǎn)生自身抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生大量IgG、IgM并激活補(bǔ)體，促使肥大細(xì)胞釋放大量組胺導(dǎo)致高原肺水腫的發(fā)生。這些研究提示，低氧致機(jī)體的防御功能損傷，使炎性免疫疾病發(fā)生。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，血小板在炎癥和免疫反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用，與炎癥性腸病、動脈粥樣硬化癥和瘧疾感染等發(fā)生相關(guān)[3-5]。渠晶等[6]的研究顯示，體內(nèi)活化狀態(tài)的血小板表面CD40L與內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子釋放相關(guān)，并參與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程?；加醒装Y性腸病的患者體內(nèi)血小板活化標(biāo)志物P-select和CD40L表達(dá)水平顯著增高，同時血漿內(nèi)PF4、sCD40L和β-TG的表達(dá)均增高。而高原低氧環(huán)境對血小板活化也有影響。TarunTyagi等[7]的研究顯示，高海拔急性低氧可以引起血小板數(shù)目減少、血小板活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致靜脈血栓發(fā)生。T.Lehmann等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，血小板活化與高原肺水腫的發(fā)生相關(guān)。Inder Singh[9]的研究顯示，高原肺動脈高壓患者體內(nèi)血小板活性增強(qiáng)，血小板聚集功能較平原組居住高海拔地區(qū)無肺動脈高壓者明顯增強(qiáng)，而且發(fā)生肺動脈高壓患者的血小板數(shù)目升高。這些研究說明高原低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)血小板活性增高，誘發(fā)高原急慢性疾病的發(fā)生，但血小板活化后是否參與了高原低氧環(huán)境導(dǎo)致的炎癥性疾病目前鮮有研究。因此，我們的研究對比了不同海拔條件下血小板活化程度及血小板分泌的炎性因子表達(dá)水平。

本研究結(jié)果顯示，三組不同海拔高度大鼠Hb比較有統(tǒng)計學(xué)差異，特高海拔組明顯高于中海拔組和平原組。此外，血氣分析提示Sa02隨著海拔高度的升高明顯下降，說明特高海拔組大鼠模型構(gòu)建成功，可適用于本研究。不同海拔組大鼠血小板計數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異，血小板計數(shù)隨著海拔高度增高而下降，特高海拔組和中海拔組分別與平原組大鼠比較有統(tǒng)計學(xué)差異，而且特高海拔組與中海拔組比較也有統(tǒng)計學(xué)差異，這和既往研究結(jié)果一致[10]。此外，MPV和PDW三組比較有差異，其中特高海拔組、中海拔組與平原組比較有統(tǒng)計學(xué)差異，而特高海拔組與中海拔組比較均無差異。

通常情況下血小板處于靜止的狀態(tài)，血小板活化后具有釋放大量促炎作用蛋白分子(P-select、CD40L、CD40、PAF、IL-1β等炎性介質(zhì))的特性，這些物質(zhì)參與血小板-內(nèi)皮細(xì)胞和血小板-中性粒細(xì)胞反應(yīng)從而促使炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展。P-select(CD62P)是血小板胞內(nèi)a顆粒的膜糖蛋白，靜止期的血小板不表達(dá)CD62P，血小板活化后CD62P暴露于血小板膜表面。因此，CD62P被認(rèn)為是血小板活化的標(biāo)記物。我們用流式細(xì)胞儀檢測了特高海拔組和中海拔組大鼠血小板CD62P的陽性表達(dá)率，特高海拔組大鼠CD62P的表達(dá)明顯高于中海拔組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明低氧可以誘導(dǎo)血小板活化且隨著海拔的升高被活化程度越明顯。CD62P可以與單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞上相應(yīng)的受體PSGL-1相互作用，使血小板聚集在這些細(xì)胞周圍并粘附至血管內(nèi)皮細(xì)胞觸發(fā)一系列促炎反應(yīng)[11]。臨床上P-select和可溶性P-select可以作為膿毒血癥早期識別的生物標(biāo)志物[12]。而CD40L-CD40介導(dǎo)的血管壁炎癥反應(yīng)在心血管疾病中發(fā)揮著重要作用。健康人血小板在體外經(jīng)誘導(dǎo)活化后，CD40L的表達(dá)增加，并與內(nèi)皮細(xì)胞表面的CD40結(jié)合后促使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)相關(guān)炎性因子[13]。PAF是一種強(qiáng)效的內(nèi)源性磷酯類介質(zhì)，在內(nèi)毒素血癥、過敏性哮喘和急性炎癥等疾病的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。本研究對比了特高海拔組大鼠和平原組大鼠PRP中P-select和CD40L、CD40、PAF的表達(dá)水平，結(jié)果顯示特高海拔組大鼠PRP中上述炎性因子表達(dá)水平均高于平原組大鼠，且有統(tǒng)計學(xué)差異。既往研究也顯示低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)P-select和CD40L、CD40、PAF的表達(dá)水平增高[14-17]，這與我們的研究結(jié)果一致。盡管目前結(jié)果不能確定血小板分泌的炎性因子具體參與了哪種高海拔低壓低氧環(huán)境誘導(dǎo)的炎性疾病，但是我們的研究結(jié)果首次提示血小板活化可能參與了高海拔低壓低氧導(dǎo)致的炎性疾病。

總之，高原低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)血小板活化，而活化的血小板可以分泌一些炎癥介質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)有可能參與了與低氧相關(guān)的炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展，這為我們今后治療與低氧相關(guān)的炎性疾病提供了新的思路，抗血小板藥物在治療這類疾病時可能會發(fā)揮特殊的作用。

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