藏藥十八味黨參丸抑制CIA大鼠滑膜組織炎性因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)※

朱艷媚，祁 崗，楊春燕，楊本扎西，曹成珠，嚴(yán)云飛

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室，810001；2.青海省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，810007；3.青海省藏醫(yī)院藥浴科，810007)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。藏藥十八味黨參丸(tibetan eighteen flavor dangshenpills，TEP)治療RA療效確切、毒副作用小[1，2]。本研究通過觀察TEP對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠滑膜組織炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的影響，探討TEP改善CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及分組

清潔級(jí)雌性SD大鼠60只，質(zhì)量180±20 g，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(甘)20160003。隨機(jī)分為空白對(duì)照組(Control)、模型組(CIA)、雷公藤多苷組(TP)、TEP低劑量組(TEPⅠ)、TEP中劑量組(TEPⅡ)、TEP高劑量組(TEP Ⅲ)，每組10只。

1.1.2 試劑及藥物

TEP(國藥準(zhǔn)字Z63020215，青海柴達(dá)木高科技藥業(yè)有限公司)；雷公藤多苷片(tripterygium，TP。浙江得恩德制藥有限公司)。大鼠白細(xì)胞介素17(interleukin，IL-17)ELISA、兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白多克隆抗體(Bcl-2 Associated X Protein，BAX)、兔抗B細(xì)胞淋巴瘤-2多克隆抗體(B cell lymphoma 2，BCL-2)、兔抗核轉(zhuǎn)錄因子kappa B多克隆抗體(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、兔抗半胱天冬酶-3多克隆抗體(caspase 3)、兔抗腫瘤壞死因子α多克隆抗體(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、兔抗β-actin多克隆抗體(CST)試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CIA模型建立

本研究所有大鼠實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求并獲得蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審查，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)文獻(xiàn)[3]建立CIA大鼠模型，將大鼠仰臥位固定，大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射與牛Ⅱ型膠原蛋白等體積混合的卡介苗溶液(Bacillus Calmette-Guérin，BCG，4mg/mL)，每次每個(gè)關(guān)節(jié)腔注射0.2 mL，1周重復(fù)一次，共2周。正常對(duì)照組大鼠等量同部位注射生理鹽水。

1.2.2 模型評(píng)價(jià)

每周用游標(biāo)卡尺測定大鼠膝關(guān)節(jié)直徑，測定3次，取其平均值；觀察大鼠的一般狀態(tài)、足爪厚度。

一般狀態(tài)：初次免疫后，第1天觀察對(duì)照組大鼠活動(dòng)正常，膝關(guān)節(jié)無紅腫，毛色發(fā)亮柔順，對(duì)外界刺激敏感，而模型組大鼠膝關(guān)節(jié)紅腫明顯，出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)，雙后肢僵直，行走困難，瘸拐和拖后腿現(xiàn)象明顯，活動(dòng)受限，精神萎靡，對(duì)外界刺激不敏感，抓取時(shí)無掙扎，同時(shí)觸摸膝關(guān)節(jié)時(shí)出現(xiàn)強(qiáng)烈的保護(hù)性回縮現(xiàn)象。第3天模型組大鼠紅腫有所緩解，但后肢依然僵硬，行走困難，精神萎靡，毛色暗淡，無光澤。到第5天時(shí)，模型組大鼠腫漲未見明顯減退，但活動(dòng)度與空白組相同，皮毛已變得柔順，有光澤，行走略微顯得僵硬，精神狀態(tài)較之前恢復(fù)很多，對(duì)外界刺激敏感度和空白幾乎一樣，但觸摸膝關(guān)節(jié)時(shí)出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)的回縮現(xiàn)象。第7天進(jìn)行二次加強(qiáng)免疫后，大鼠膝關(guān)節(jié)反應(yīng)狀態(tài)同第一次幾乎一致，第8天毛顯枯槁，急性炎癥性紅腫較前明顯，大鼠幾乎沒有活動(dòng)，偶爾有活動(dòng)的大鼠，雙后肢也是僵硬拖行，對(duì)外界刺激很不敏感，觸碰后肢，會(huì)明顯地保護(hù)性回縮，甚至出現(xiàn)尖叫。第14天，大鼠膝關(guān)節(jié)依然腫脹，但無紅色，對(duì)外界刺激敏感，略有跛行，但不影響正?；顒?dòng)，毛色較光亮。

關(guān)節(jié)厚度：第一次免疫及第二次免疫后第1、3、5天，與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)厚度顯著增加，表明模型建立成功。

1.2.3 給藥

造模成功后，給予藥物灌胃干預(yù)，TEP低劑量組劑量為9 g/kg/d，TEP中劑量組為45 g/kg/d，TEP高劑量組為90 g/kg/d，TP組為12 mg/kg/d，連續(xù)給藥6周。

1.2.4 滑膜樣品制備

采用頸椎脫臼方法處死大鼠，在超凈工作臺(tái)，仰位固定，常規(guī)碘伏、酒精消毒。沿膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚直至暴露出以膝關(guān)節(jié)為中心約3 cm×3 cm的區(qū)域，用有齒鑷提起髕骨，沿髕骨上緣處向下切割直至股骨，再分別沿髕骨兩側(cè)向下分離至脛骨，此時(shí)即打開了膝關(guān)節(jié)腔，可見由髕骨下緣向上延緩有一層平滑光亮呈淡黃色的滑膜組織。完整剝離滑膜組織，用眼科鑷輕輕夾住其游離端，用刀片完整切下，一部分轉(zhuǎn)移至離心管后置-80 ℃冰箱備用。另一部分浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.5 HE染色

取新鮮的關(guān)節(jié)腔滑膜組織，切成 3 mm×5 mm×2 mm大小的小塊；將取材組織放在無菌培養(yǎng)皿中用4%多聚甲醛固定24小時(shí)；行梯度酒精脫水，依次進(jìn)行二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片(5μm)、常規(guī)脫蠟、蘇木素浸染、鹽酸乙醇分色、伊紅浸染、脫水、透明及封片，用光鏡觀察并拍照。顯微鏡下觀察大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)的改變，并按照滑膜病理5級(jí)評(píng)分法對(duì)炎性細(xì)胞浸潤、滑膜細(xì)胞增生及滑膜纖維組織增生三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分。炎性細(xì)胞浸潤：每高倍視野(×200)下無炎性細(xì)胞浸潤為0分；有1～5個(gè)炎性細(xì)胞為1分；有6～10個(gè)炎性細(xì)胞為2分；>11個(gè)炎性細(xì)胞為3分，每個(gè)組織切片選取5個(gè)視野。

1.2.6 ELISA實(shí)驗(yàn)

取適量滑膜組織，加入適量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)研磨，離心后取上清液。按照大鼠IL-17 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。檢測450 nm OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測樣品IL-17濃度。

1.2.7 免疫組化實(shí)驗(yàn)

1.2.8 Western Blot實(shí)驗(yàn)

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HE染色及各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜IL-17水平比較

與對(duì)照組相比，CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜有大量炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞增生，部分滑膜組織纖維化，HE染色評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

與CIA大鼠相比，TP組及TEP高劑量組炎癥細(xì)胞明顯減少，炎癥評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而關(guān)節(jié)滑膜中IL-17的表達(dá)CIA組較對(duì)照組高表達(dá)(P<0.05)，并且TP及各不同劑量組的表達(dá)較CIA組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表1。

A為Control組，B為CIA模型組，C為TP組，D為TEPⅠ組，E為TEPⅡ組，F(xiàn)為TEPⅢ組(×100)

圖1滑膜組織HE染色圖

Figure1TheHEstainingofsynovialtissue(×100)

Table 1 Inflammatory cell infiltration score of HE staining and the concentration changes of IL-17(±s)

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05.

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜TNF-α的表達(dá)

與對(duì)照組大鼠相比，CIA模型組TNF-α表達(dá)顯著增加(P<0.05)。與模型組大鼠相比，TP及高劑量TEP治療組大鼠TNF-α表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表2。

A為Control組，B為CIA模型組，C為TP組，D為TEPⅠ組，E為TEPⅡ組，F(xiàn)為TEPⅢ組(×200)

圖2各組大鼠滑膜細(xì)胞TNF-α的表達(dá)圖

Figure2TheexpressionofTNF-αinsynovialcellsofrats(×200)

Table 2The average optical density value of TNF-α in synovial tissue of rats(±s)

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05.

2.3 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜caspase-3、NF-κB、BCL-2及BAX表達(dá)比較

CIA組NF-κB表達(dá)較對(duì)照組高表達(dá)、Caspase 3低表達(dá)、BCL-2與BAX比值顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，TP及不同劑量TEP組大鼠NF-κB表達(dá)、BCL-2與BAX比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而Caspase 3表達(dá)，TP及中、低劑量TEP組表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但高劑量組未見差異(P>0.05)。見圖3、表3。

圖3各組大鼠Westernblot印跡圖

Figure3TheresultsofWesternblotindifferentgroupsofrats

Table 3 The relative expression levels of related factors in rats’ synovial tissue(±s)

*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05.

3 討論

目前，大部分治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物都是基于抑制炎癥反應(yīng)，改善滑膜炎性環(huán)境，靶向于身體的免疫細(xì)胞和免疫因子?；び擅庖吣褪芟蛎庖哌^敏轉(zhuǎn)變是慢性炎癥的基礎(chǔ)，這種轉(zhuǎn)變跟環(huán)境遺傳以及感染等相關(guān)。在炎性環(huán)境中，滑膜組織不斷接受炎性因子的刺激導(dǎo)致滑膜細(xì)胞凋亡抑制、增生異常，而異常增生的滑膜又不斷破壞軟骨等組織導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥加重，形成惡性循環(huán)。因此，阻止滑膜組織的異常增生對(duì)緩解關(guān)節(jié)炎具有重要意義。

TEP在臨床上具有治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕及痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用[1，2]。但是其治療機(jī)制尚不明確，本研究通過觀察TEP對(duì)CIA大鼠滑膜組織炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的影響，探討TEP改善CIA大鼠RA的分子機(jī)制。

由CD4+T細(xì)胞分泌的IL-17，能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞合成分泌白細(xì)胞介素6(interleukin，IL-6)、白細(xì)胞介素8(interleukin，IL-8)、粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達(dá)，它在關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起到起始促進(jìn)作用，誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞和炎癥細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥因子，激活增強(qiáng)相關(guān)信號(hào)通路[4，5]。研究表明，RA患者外周血單核細(xì)胞中Th17細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)更敏感[6]。而RA患者IL-17可導(dǎo)致線粒體功能障礙從而增加滑膜細(xì)胞抗凋亡作用[7]。此外，NF-κB在CIA大鼠滑膜組織主要定位于細(xì)胞核，且表達(dá)升高，NF-κB的調(diào)控與活化在RA的病理變化中占有重要地位[8]。IL-17與受體結(jié)合后，可通過NF-kB途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用。當(dāng)滑膜細(xì)胞受到IL-17的刺激時(shí)，NF-κB抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)被降解，NF-κB異二聚體移位到胞核內(nèi)，與DNA上的κB基序列相結(jié)合從而調(diào)控各種TNF-α與白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)，反過來所產(chǎn)生的炎癥因子又可進(jìn)一步激活NF-κB通路，形成正向調(diào)控循環(huán)，使關(guān)節(jié)炎得以維持發(fā)展。NF-κB對(duì)維持細(xì)胞存活和抗凋亡具有重要作用[9-12]。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA、Western blot和免疫組化法發(fā)現(xiàn)與空白組相比較，CIA模型大鼠的滑膜細(xì)胞中IL-17、NF-κB和TNF-α表達(dá)量明顯升高(P<0.05)，經(jīng)過TEP治療后，中高劑量組滑膜細(xì)胞中IL-17、NF-κB和TNF-α的含量明顯降低(P<0.05)，表明TEP可明顯改善關(guān)節(jié)炎炎癥環(huán)境。

研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因上有κB識(shí)別位點(diǎn)，而Bax、BCL-2/BCL-XL相關(guān)死亡促進(jìn)因子(BCL-xL/BCL-2-associated death promoter，Bad)則無κB位點(diǎn)?；ぜ?xì)胞中NF-κB大量激活可引起B(yǎng)cl-2家族中抗細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)增加，進(jìn)而發(fā)揮此類因子降低線粒體膜的通透性、抑制線粒體去極化及細(xì)胞色素C釋放的抗凋亡作用[13-15]，這是滑膜細(xì)胞大量增生的主要原因之一。超表達(dá)的Bcl- 2蛋白一方面可與bax形成異源二聚體，抑制bax的轉(zhuǎn)位及二聚體化，關(guān)閉PT孔道，通過阻斷細(xì)胞色素C(cytochrome C，cyt-c)的釋放，抑制下游caspase-3的激活，而有效地抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[16]。另一方面，Bcl-2還能與凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1)結(jié)合并抑制其功能，阻止半胱天冬酶-9前酶(procaspase-9)活化實(shí)現(xiàn)抗凋亡的效應(yīng)[17]。增加BAX且降低Bcl-2表達(dá)的藥物可以緩解RA患者癥狀，如有研究表明復(fù)方丹參注射液、牛蒡子苷元可以通過增加RA患者BAX及降低Bcl-2表達(dá)從而促進(jìn)滑膜細(xì)胞的凋亡，緩解RA患者癥狀[18，19]。此外，抗炎藥物甲氨蝶呤可以提高RA患者滑膜細(xì)胞Caspase-3 mRNA水平從而改善炎癥情況[20]。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot發(fā)現(xiàn)在CIA模型組大鼠滑膜中Bcl-2/Bax的比值明顯高于空白組(P<0.05)，Caspase-3的含量明顯低于空白組，經(jīng)過TEP治療后，CIA大鼠滑膜中Bcl-2/Bax的比值較模型組明顯降低(P<0.05)，而Caspase-3的含量明顯提高，表明TEP通過提高滑膜組織中Caspase-3的含量，降低Bcl-2/Bax的比值促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡，從而抑制滑膜異常增生。由于NF-κB可誘導(dǎo)表達(dá)Bcl-2，提示TEP可能通過抑制滑膜細(xì)胞NF-κB的表達(dá)，從而抑制Bcl-2的表達(dá)、促進(jìn)滑膜細(xì)胞凋亡。

綜上所述，TEP可通過抑制CIA大鼠滑膜細(xì)胞中IL-17、NF-κB和TNF-α的表達(dá)，改善關(guān)節(jié)炎癥情況。此外，TEP可提高滑膜組織中Caspase-3的含量，并降低Bcl-2/Bax的比值，以此促進(jìn)滑膜細(xì)胞的凋亡，從而抑制滑膜的異常增生。提示，TEP通過抑制CIA大鼠滑膜組織的炎癥反應(yīng)并促進(jìn)滑膜細(xì)胞的凋亡，改善CIA大鼠關(guān)節(jié)的炎癥。

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