高原肺水腫患者rs1193789、rs1516386、rs474096、rs566456、rs2322433單核苷酸位點的多態(tài)性分析*

杜 慧，趙 婧，韻海霞，劉永年，楊應忠，3△

(1.青海大學研究生院，青海 西寧 810001；2.青海大學醫(yī)學院，青海 西寧 810001；3.青海大學高原醫(yī)學研究中心，青海 西寧 810001)

高原肺水腫(high altitude pulmonary edema，HAPE)發(fā)病機制迄今為止仍然不清楚，國內外研究者們提出HAPE的發(fā)生是遺傳和環(huán)境雙重因素作用的結果，具有遺傳易感性[1]。與HAPE易感性相關的遺傳基礎研究多集中在eNOS、Hsp70、VEGF和血管緊張素及其受體、人白細胞抗原等基因的病例-對照關聯(lián)分析[2-3]，但是均未明確發(fā)現(xiàn)與HAPE發(fā)病機制密切相關的遺傳基礎。

自2012年以來，課題組通過Affymetrix SNP 6.0芯片進行全基因組關聯(lián)分析，篩選出在對照組與病例組間有顯著差異的SNP位點。本次研究選取其中5個SNPs位點，采用Sequenom MassARRAY?SNP分型技術檢測這些多態(tài)性位點，并分析與HAPE的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本次研究的HAPE患者(HAPE patient，HAPE-p)共133例，均為漢族，男性，平均年齡為40.20±9.91歲，無親緣關系。在青海省玉樹州援建時發(fā)病，并在玉樹州人民醫(yī)院確診為HAPE。這些患者平時體健，既往無高原病病史，無心血管疾病、糖尿病、先天性心臟病、基礎肺部疾病、肺發(fā)育不良等干擾本研究結果的疾病。健康對照組(HAPE-control，HAPE-c)135例，選取漢族，男性，既往體健，平均年齡為40.92±5.15歲，對其行常規(guī)體檢及有關生理指標檢測。用統(tǒng)計表收集研究對象的一般情況。本研究經(jīng)青海大學醫(yī)學院倫理審查委員會審查并通過，并與所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 儀器與材料

UVP凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司)，DU800核酸檢測儀、5415D高速離心機(德國Eppendorf公司)，BIO-RAD PCR 擴增儀( 美國伯樂)，DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)。Gentra Puregene Blood Kit血液基因組提取試劑盒(德國Qiagen158389)，1.5 mL EP管、200 μL PCR 管(AXYGEN SCIENTIFIC公司) 。其他為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 候選位點

前期GWAS結果提示這些基因與免疫調節(jié)炎癥、脂質代謝、胞內能量代謝、葡萄糖轉運、鉀鈣離子轉運、血管內皮功能、肺臟發(fā)育、炎癥損傷等相關[4]。因此，篩選出以下5個SNP位點(表1)進行分析。

表1候選SNPs信息表

Table 1 Information about Candidate SNPs

1.4 實驗方法

1.4.1 基因組DNA提取

分別抽取病例組和對照組外周靜脈血各4 mL，用EDTA鉀抗凝，離心(4000r/min)10 min，吸上層血漿至凍存管，置-80 ℃冰箱保存；吸取白細胞層至新的15 mL離心管，加入紅細胞裂解液混勻，充分裂解后離心棄上清液，重復上述步驟至只有白細胞，加入白細胞裂解液混勻，室溫保存。用Gentra Puregene Blood Kit基因組提取試劑盒，提取室溫保存的樣本中的白細胞基因組DNA，用核酸檢測儀測定濃度，并將樣本基因組DNA稀釋到200 ng/μL，樣本基因組DNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min后檢測條帶的完整性。置-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 基因分型

采用Sequenom MassARRAY?SNP分型檢測方法，通過多重PCR技術、iPLEX單堿基延伸技術、基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析質譜技術(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，MALDI-TOF)進行分型檢測。使用Sequenom 公司MassARRAY Assay Design及Genotyping Tools軟件設計待測SNP位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物，并交給生物公司合成。

1.4.3 PCR擴增

利用多重PCR技術，反應體系總體積為5 L。反應體系(5μL)包含PCR master mix溶液、模板DNA 20-50 ng、Hotstar Taq 0.5 U，每條擴增引物0.5 pmol，0.1 μL的25 mM dNTPs。PCR反應條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45 個循環(huán)；72 ℃ 3 min；4 ℃維持。為了去除體系中游離的dNTPs，在PCR反應結束后，把PCR產(chǎn)物用SAP處理。將SAP Mix加入PCR反應板，反應體系總體積為7 μL，其中PCR產(chǎn)物5 μL，SAP混合液2 μL。PCR反應條件：37 ℃ 40 min；85 ℃ 5 min；4 ℃維持。用堿性磷酸酶處理結束后，進行單堿基延伸反應，反應體系總體積 9 μL，包含EXTEND Mix 2 μL，SAP處理后PCR產(chǎn)物7 μL。PCR反應條件：94 ℃ 30 s，4個循環(huán)(52℃ 5 s，80℃ 5 s)，39個循環(huán)(94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s)，72 ℃ 3 min，4 ℃維持。在單堿基延伸反應的結果中加入16 μL的水后將樹脂倒入孔中進行純化，用MassARRAY Nanodispenser RS1000點樣儀進行芯片點樣，最后使用MALDI-TOF分析，檢測結果使用TYPER 4.0軟件(sequenom)分型并輸出結果。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用Excel 2013軟件行哈迪-溫伯格遺傳平衡檢驗；應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，各基因型及等位基因頻率的比較采用卡方檢驗，顯著性檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 候選SNPs分型結果

本實驗對268個樣本的SNP進行分型(圖1)。Sequenom MassARRAY?SNP檢測是把SNP位點引起的堿基差異轉化成分子量大小的差異來體現(xiàn)，通過MALDI-TOF技術檢測延伸產(chǎn)物分子量的大小，應用專用的分析軟件MassArray TYPER 4.0進行處理，通過判斷分子量大小的差異來進行SNP分型。

圖1根據(jù)分子量的差異判斷延伸產(chǎn)物分型結果

Figure1Thetypingresultoftheelongationproductdeterminesaccordingtothedifferenceofmolecularweight

2.2 Hardy-Weinberg檢驗結果

分別對HAPE-p組和HAPE-c組行哈迪-溫伯格檢驗，檢驗結果顯示所有SNP位點均符合Hardy-Weinberg檢驗平衡定律(P>0.05)，說明群體基因遺傳平衡(表2)。

表2 SNP哈迪-溫伯格平衡檢驗表

Table 2 SNP Hardy Weinberg equilibrium test

*：由于檢測過程中部分樣本檢測失敗導致表中HAPE組的兩個位點的實際檢測總數(shù)小于研究總例數(shù)；**：由于檢測過程中部分樣本檢測失敗導致表中對照組各位點的實際檢測總數(shù)小于研究總例數(shù).

2.3 候選SNPs基因型與等位基因頻率

rs1193789、rs1516386、rs474096、rs566456、rs2322433的基因型AA在HAPE組和對照組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(表3)。同時，等位基因A在HAPE組中的頻率明顯高于對照組。rs1193789、rs1516386、rs474096、rs566456的隱性遺傳基因型AA+AG、AA+AT、AA+AC和AA+AG在HAPE組中的基因型頻率明顯高于對照組[OR(95%)為2.022(1.148-3.564)，P=0.014]、[OR(95%)為1.710(1.041-2.809)，P=0.033]、[OR(95%)為2.184(1.243-3.838)，P=0.006]、[OR(95%)為2.104(1.203-3.681)，P=0.008]。但是，rs2322433的隱性基因型AA+AG在HAPE組和對照組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.184)。

表3候選SNPs位點在HAPE組與對照組中基因型及等位基因頻率分布表

Table 3Distribution of the Genotypic and Allelic Frequencies of the Candidate SNPs between HAPE and Healthy Groups

續(xù)表：

位點HAPE組(n=133)對照組(n=135)χ2POR(95%CI)rs1516386?/??AA22(20．37)11(13．25)7．0210．030AT64(59．26)61(73．49)TT44(40．74)63(75．90)A108(41．54)83(30．74)6．7000．0101．601(1．120-2．288)T152(58．46)187(69．26)AA22(16．92)11(8．15)4．6770．0312．296(1．065-4．951)AT+TT108(83．08)124(91．85)TT44(33．85)63(46．67)4．5220．0331．710(1．041-2．809)AA+AT86(66．15)72(53．33)rs474096??AA37(27．82)22(16．42)9．6400．008AC71(53．38)67(50．00)CC25(18．80)45(33．58)A145(54．51)111(41．42)9．1700．0021．695(1．203-2．387)C121(45．49)157(58．58)AA37(27．82)22(16．42)5．0410．0251．962(1．083-3．554)AC+CC96(72．18)112(83．58)CC25(18．80)45(33．58)7．5430．0062．184(1．243-3．838)AA+AC108(81．20)89(66．42)rs566456??AA34(25．56)22(16．54)8．0080．018AG73(54．89)66(49．62)GG26(19．55)45(33．83)A141(53．01)110(41．35)7．2490．0071．600(1．135-2．254)G125(46．99)156(58．65)AA34(25．56)22(16．54)3．2570．071AG+GG99(74．44)111(83．46)GG26(19．55)45(33．83)6．9360．0082．104(1．203-3．681)AA+AG107(80．45)88(66．17)rs2322433??AA50(37．59)32(24．06)5．9720．050AG58(43．61)67(50．38)GG25(18．80)34(25．56)A158(59．40)131(49．25)5．5220．0191．508(1．070-2．125)G108(40．60)135(50．75)AA50(37．59)32(24．06)5．7120．0171．901(1．119-3．231)AG+GG83(62．41)101(75．94)GG25(18．80)34(25．56)1．7640．184AA+AG108(81．20)99(74．44)

*：由于檢測過程中部分樣本檢測失敗導致表中HAPE組的兩個位點的實際檢測總數(shù)小于研究總例數(shù)；**：由于檢測過程中部分樣本檢測失敗導致表中對照組各位點的實際檢測總數(shù)小于研究總例數(shù).

3 討論

現(xiàn)有文獻報道，急進高原后在調節(jié)血管通透性和血管舒縮功能及血管內穩(wěn)態(tài)的多基因通路上發(fā)生了基因的異常表達，這些基因共同促進肺動脈收縮效應的放大和HAPE的發(fā)生發(fā)展，說明HAPE的發(fā)生是多基因調控的疾病[4]。然而，對于這些基因在不同學者的研究結果中的重復性并不一致，許多基因仍然需要進一步的驗證。本研究針對前期工作選出的5個SNP位點，發(fā)現(xiàn)rs1193789、rs1516386、rs474096、rs566456、rs2322433的基因型頻率在HAPE組和對照組之間的差異均有統(tǒng)計學意義。

rs1193789、rs474096、rs566456位點位于11號染色體，分別位于編碼有機陰離子轉運蛋白超家族中的SLC22A9和SLC22A10。SLC22A9在肝臟中高表達，是溶質載體家族的一員，能被肝細胞核因子HNF-1α激活[5]。HNF-1α是細胞中肝細胞核因子(HNF)的一個亞型，HNF-1α在胰腺β細胞和肝細胞中高表達，參與體內葡萄糖及脂肪代謝的調節(jié)過程，是一種轉錄調節(jié)因子，在轉錄水平參與包括葡萄糖激酶在內的多種蛋白質的表達過程。

人類運輸體溶質載體家族，是基于序列的同源性和底物的專一性形成的有機陽離子交換器，及兩性離子協(xié)同轉運蛋白、有機陰離子轉運蛋白，由23個成員組成。他們在各種有機化合物腎臟的排泄中起著關鍵作用，這些有機化合物包括藥物、毒素和內源性代謝物。藥物遺傳學研究清楚地表明，SLC22A轉運蛋白在吸收、分發(fā)和消除各種內源性化合物和藥物中扮演重要的角色。在溶質載體蛋白中，SLC22A9對內源性和外源性帶負電荷的陰離子化合物的消除或再吸收起著重要的作用[6-9]。

rs1193789位點的下游是葡萄糖易化轉運蛋白9基因(GLUT9/SLC2A9)，它與尿酸代謝密切相關，在尿酸重吸收中發(fā)揮重要的作用。目前，推測GLUT9的功能是將被吸收入腎小管上皮細胞內的尿酸轉運到腎間質中，這一過程主要由位于基底膜側的GLU9L完成[10]。rs566456的下游基因是RTN3，它是RTN家族的成員之一，RTNs可參與轉運蛋白、調節(jié)細胞凋亡、調節(jié)β分泌酶活性及抑制神經(jīng)再生等過程。RTN3定位于內質網(wǎng)膜上，通常被認為是一個誘導細胞凋亡的蛋白，HAPE的發(fā)病中最主要的因素是缺氧，缺氧可以引起一系列生理病理過程，如凋亡、信號轉導、蛋白代謝、心臟興奮-收縮偶聯(lián)等。內質網(wǎng)調節(jié)蛋白質合成、折疊和轉運，并且可以調節(jié)細胞應激反應和細胞內鈣離子水平，細胞內鈣離子濃度對維持細胞正常功能非常重要[11]。在哺乳動物細胞中，RTN3與Bcl-2結合在內質網(wǎng)上，BCL-2家族蛋白對細胞內Ca2+的調節(jié)可能通過以下兩種機制來實現(xiàn)：(1)調控細胞凋亡過程中Ca2+的重新分布；(2)調控細胞凋亡中內質網(wǎng)鈣庫Ca2+的排空，所以在HAPE的發(fā)病過程中不均一性的離子通道的激活，如細胞膜的鈣離子通透性增加，均可導致肺動脈收縮及肺動脈壓力增高[11-12]。rs1516386位于3號染色體上，編碼細胞黏附分子CNTN4基因，是軸突相關黏附分子TAG-1/F3的亞組的一員，在神經(jīng)網(wǎng)絡的形成、維持和可塑性中起重要作用。全縱長由6個免疫蛋白域和4個纖維蛋白(FNIII)域組成，通過糖基磷脂酰肌醇連接[12]。研究還發(fā)現(xiàn)，CNTN4在大腸直腸癌的生成和發(fā)展中具有抑癌的作用。rs1516386位點的下游基因為IL-5。研究顯示，IL-5誘導嗜酸性粒細胞具有特異性，主要調節(jié)嗜酸性粒細胞生長、分化。炎癥反應過程中的T淋巴細胞刺激支氣管黏膜產(chǎn)生的IL-5能選擇性作用于嗜酸性粒細胞，IL-5可引起肺嗜酸性粒細胞明顯增多及支氣管收縮介質反應性增加，從而引起一系列肺部疾病[13]。人體快速進入高原后，在低壓缺氧環(huán)境下，各種誘因引起的肺動脈壓力驟然升高，肺毛細血管靜水壓升高，血管收縮不平衡，收縮較弱的區(qū)域灌注增強，造成區(qū)域水腫，液體通過靠近阻力血管的動脈壁漏出、轉移和潴留，引起肺間質和肺泡疾病。由此可見，炎性因子在HAPE的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要的角色。

rs2322433位點的上游基因為QKI，QKI基因屬于STAR(signal transduction and activation of RNA)家族的一種RNA結合蛋白，它能與一些炎癥有關的靶分子，如VCAM，COX-2等結合。QKI基因含有9個外顯子，由于在進化過程中高度保守，所以有一定的特異性，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和在胚胎發(fā)育中分別參與髓鞘發(fā)育和心血管系統(tǒng)發(fā)育，故大多數(shù)與QKI基因有關的研究集中在髓鞘發(fā)育的分子水平上；進一步研究發(fā)現(xiàn)，胚胎心血管系統(tǒng)嚴重的發(fā)育障礙，是由QKI基因特定部位的突變導致的。對QKI基因啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)其具有NF-κB的結合位點。NF-κB是一種對氧化還原敏感的轉錄因子，可以調節(jié)許多與炎癥有關的基因表達，來啟動炎癥的發(fā)生，在胚胎的發(fā)育過程中也扮演著不可或缺的角色。因此，NF-κB可在與炎癥有關疾病的發(fā)生發(fā)展轉歸過程中發(fā)揮重要的作用[14]。由此可見，基因改變在HAPE的發(fā)病機制中扮演重要角色，主要表現(xiàn)為，在低氧環(huán)境下與個體易感性密切相關。這些基因可能會成為一種重要的分子標志物。

本次研究通過對HAPE患者rs1193789、rs1516386、rs474096、rs566456、rs2322433這5個多態(tài)性位點的分析，發(fā)現(xiàn)基因型AA和等位基因A可能是HAPE發(fā)生的一個重要危險因素。在接下來的工作中，我們將繼續(xù)分析HAPE患者其他的多態(tài)性位點，探討研究與HAPE發(fā)病有關的其他危險因素。

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