多房棘球蚴表面抗原EMY162的原核表達(dá)及抗體制備※

馮 琳，李潤(rùn)樂，劉川川，廖 瑜，楊全余*，湯 鋒，3**

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)高原人畜共患病研究所，青海 西寧 810001)

泡型包蟲病又稱多房棘球蚴病(Alveolar Echinocococosis，AE)。由于多房棘球蚴生長(zhǎng)緩慢，且成浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，感染后一般潛伏期較長(zhǎng)。目前尚缺乏有效的針對(duì)泡型包蟲病行之有效的早期診斷方法，包蟲病的診斷依然依賴B超、CT等影像學(xué)方法，往往經(jīng)影像學(xué)確診的病人已經(jīng)進(jìn)入晚期。并且目前對(duì)于多房棘球蚴病灶邊緣帶的判斷并無明確界定[1]，即便進(jìn)行臨床手術(shù)也只能依據(jù)影像學(xué)所顯示的病灶“解剖學(xué)邊界”實(shí)施病灶切除，造成部分病灶切除后病情仍會(huì)反復(fù)[2]。

EMY162是由日本學(xué)者Katoh等首次發(fā)現(xiàn)并命名[3]，后續(xù)研究證實(shí)EMY162表達(dá)于絳蟲的四個(gè)階段(原頭節(jié)、續(xù)絳、幼蟲和成蟲)的蟲體蛋白[4]?；谏鲜鰞?nèi)容本課題采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成目的基因EMY162，并將其克隆入表達(dá)載體pCzn1后，將獲得的重組質(zhì)粒pCzn1-EMY162克隆入Arctic Express，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后利用親和層析(Ni 柱)獲得目的蛋白后將純化的目的蛋白EMY162免疫新西蘭白兔，親和純化獲得多克隆抗體并對(duì)該抗體進(jìn)行了效價(jià)與純度的考察。

1 材料與方法

1.1 材料

pCzn 1載體、Arctic Express菌株(由鐘鼎生物保種)；限制性內(nèi)切酶Nde Ⅰ、Xba Ⅰ、T4 DNA連接酶(購自Takara公司)；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒和瓊脂糖凝膠電泳材料、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、氨芐青霉素、異丙基硫代半乳糖苷、卡那霉素(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司)；Ni-IDA-Sepharose(南京金斯瑞生物科技有限公司，CL-6B)；Protein Marker(Thermo 公司)；Acr、Bis、Tris和弗氏佐劑(購自 Sigma 公司)；SDS、TEMED(購自 BIO-RAD 公司)；封閉液、包被液、顯色液、Tyrptone、Yeast Extract(購自 OXOID 公司)[5]。

1.2 方法

1.2.1 pCzn1-EMY162質(zhì)粒構(gòu)建

參照前期實(shí)驗(yàn)方法[5]，將OptimumTM Codon軟件用于大腸桿菌密碼子偏愛性優(yōu)化，以獲得更適合大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的堿基序列，并添加限制性內(nèi)切酶Nde Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)及pCzn1-EMY162基因序列如下：

CATATGGAAGAGGTTGGTGTAGACCCGGAACT

GATTGCGAAACTGACGAAGAAATTACAGACGACTCT

CCCGGAACATTTTCGCTGGATTCATGTAGGCTCCCG

TAGCCTGGAACTGGGCTGGAATGCGACAGGTCTGGC

CAACCTCCATGCGGATCATATTAAACTGACCGCGAAT

CTGTACACCACATACGTGAGCTTTCGCTATCGCAACG

TGCCGATTGAACGCCAAAAACTCACCCTGGAGGGCT

TGAAACCATCAACCTTCTATGAGGTCGTGGTTCAAGC

AGATCGCGCCGGCGGTTTCGCCTTGATTTTTGCAATG

GCTGGCCTTCTGCTGCTGACGTAATCTAGA

1.2.2 pCzn 1-EMY162重組菌Arctic Express(DE3)大腸桿菌表達(dá)載體構(gòu)建

1.2.3 EMY162包涵體蛋白的復(fù)性及Ni柱親和純化

將發(fā)酵液離心，收集菌體加入裂解液后超聲破碎(4℃，12500r/min)、離心(20min)后棄上清夜，沉淀加入包涵體洗滌液清洗后加入溶解緩沖液后透析[5]。溶解后的包涵體用Ni-IDA-Sepharose親和層析柱收集EMY162蛋白[6-8]。

1.2.4 動(dòng)物免疫

每年的四五月份，成群結(jié)隊(duì)的飛魚便會(huì)迫不及待地來到靠近陸地、島礁的地方，尋找適合產(chǎn)卵的場(chǎng)所。而漂浮在岸邊的棕櫚葉，對(duì)于它們來說是再合適不過的產(chǎn)卵地（海藻叢生的海域，也是飛魚喜歡的產(chǎn)卵地點(diǎn)）。

1.2.5 抗體純化與效價(jià)測(cè)定

將蛋白EMY162通過偶聯(lián)瓊脂糖介質(zhì)制備親和純化層析柱，EMY162抗血清與PBS等體積混合后緩慢上樣，待抗體結(jié)合后洗脫抗體(甘氨酸緩沖液)，將抗體放入透析袋后立即置于PBS(4℃)透析過夜后，通過電泳測(cè)定其純度、BCA測(cè)定其濃度、ELISA測(cè)定其效價(jià)[8-10]。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間比較用Dunnett-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pCzn1-EMY162的測(cè)序及對(duì)比

重組質(zhì)粒pCzn1-EMY162陽性克隆測(cè)序結(jié)果(圖1A)與預(yù)期序列于NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTN軟件進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)測(cè)序結(jié)果與預(yù)期目的序列相一致，吻合度達(dá)到100%(圖1B)。

A：重組質(zhì)粒pCzn1-EMY162測(cè)序測(cè)序結(jié)果；B：重組質(zhì)粒pCzn1-EMY162比對(duì)結(jié)果

圖1重組質(zhì)粒pCzn1-EMY162測(cè)序及比對(duì)結(jié)果圖

Figure1Recombinantplasmidpczn1-EMY162sequencingandcomparisonresults

2.2 重組質(zhì)粒EMY162酶切鑒定

重組質(zhì)粒pCzn1-EMY162經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde Ⅰ/Xba Ⅰ酶切后產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，750 bp處有目的條帶，與EMY162序列長(zhǎng)度一致(圖2)。本研究結(jié)果表明：pCzn1-EMY162目的序列已成功插入原核表達(dá)載體Arctic Express中。

Marke：100，250，500，750，1000，1500，2000，3000，5000；基因名稱：EMY162(OD260/OD280：1.83)
酶切鑒定：Nde Ⅰ/Xba Ⅰ；M：Marker；Line1：酶切前質(zhì)粒；Line2：酶切后質(zhì)粒

圖2重組質(zhì)粒pCzn1-EMY162雙酶切鑒定圖譜

Figure2Double-enzymedigestedrecombinantplasmidpCzn1-EMY162

2.3 EMY162蛋白表達(dá)部位鑒定

工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后(15℃，37℃)，菌體用PBS混懸超聲破碎上清液(可溶蛋白)，沉淀用8 M尿素混懸超聲破碎收集上清液(包涵體蛋白)，經(jīng)SDS PAGE鑒定表達(dá)部位，結(jié)果如圖3所示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)可以產(chǎn)生13 KD的目的蛋白(泳道2)，可在EMY162包涵體部位13KD見明顯條帶，在15 ℃、37 ℃下表達(dá)EMY162(均以包涵體形式表達(dá)，游道4、6)，并且在37 ℃下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于15 ℃誘導(dǎo)，故將其發(fā)酵溫度定為37 ℃。

泳道M：標(biāo)記蛋白；泳道1：未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；泳道2：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；泳道3：使用0.5 mmol/LIPTG在37 ℃誘導(dǎo)后菌液上清部分；泳道4：使用0.5 mmol/LIPTG在37 ℃誘導(dǎo)后菌液沉淀部分；泳道5：使用0.5 mmol/LIPTG在15 ℃誘導(dǎo)后菌液上清部分；泳道6：使用0.5 mmol/LIPTG在15 ℃誘導(dǎo)后菌液沉淀部分

圖3SDS-PAGE鑒定EMY162蛋白表達(dá)部位鑒定圖

Figure3SDS-PAGEofEMY162-Hisexpressionformanalysis

2.4 蛋白純化分析

包涵體經(jīng)過變性、復(fù)性，使目標(biāo)蛋白重新正確折疊并融合，隨后通過Ni柱親和純化、復(fù)性后，獲得純化后的目的蛋白EMY162，經(jīng)12% SDS-PAGE考察蛋白純度。結(jié)果如圖4所示，純化后的蛋白EMY162在16KD左右有陽性單一條帶，并未發(fā)現(xiàn)雜蛋白條帶。質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果(圖5)示，重組表達(dá)EMY162蛋白質(zhì)的分子量為16826.67，與預(yù)期結(jié)果相一致。綜上，表明EMY162原核重組表達(dá)經(jīng)以上分離純化后達(dá)到電泳純。

泳道M：標(biāo)記蛋白；泳道1：未純化蛋白；泳道2：洗脫液中的蛋白；泳道3：純化蛋白

圖4EMY162融合蛋白純化電泳圖

Figure4SDS-PAGEofEMY162-Hisfusionproteinpurification

圖5 EMY162質(zhì)譜分析圖

2.5 兔多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

Table 1 ELISA detection of changes in antibody level after 4 times of immunizations(±s，n=3)

*：P<0.01 V.S.空白血清.

Table 2 Resultsfor Antibody indirect ELISA(±s，n=3)

續(xù)表：

EMY162純化抗體DilutionOD450nm1：640002．842±0．115?1：1280002．068±0．048?1：2560001．299±0．025?1：5120000．757±0．094?對(duì)照血清0．109±0．021F 1006．230P <0．001

P<0.01 V.S.對(duì)照血清.

2.6 抗體純度鑒定

將所獲得蛋白EMY162經(jīng)瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)制備成抗原親和純化層析柱后，通過SDS-PAGE電泳觀察純化蛋白程度(圖7)示，55KD及25KD為抗體重鏈與輕鏈，未發(fā)現(xiàn)雜蛋白。提示：獲得了純度較高的多克隆抗體。

圖6純化后抗體鑒定圖

Figure6Identificationofantibodiesafterpurification

3 討論

大腸桿菌的表達(dá)是最典型的原核表達(dá)系統(tǒng)，在大腸桿菌中表達(dá)真核生物基因具有不可預(yù)測(cè)性[12，13]，有研究結(jié)果表明將外源蛋白核酸序列進(jìn)行大腸桿菌密碼子優(yōu)化后可以增加外源蛋白表達(dá)產(chǎn)量[8，14]，鑒于遺傳密碼子的偏愛性原則，本課題首先采用生物信息學(xué)軟件OptimumTM Codon，根據(jù)NCBI公布的MEY162蛋白序列進(jìn)行遺傳密碼子的優(yōu)化，并將優(yōu)化后的EMY162序列導(dǎo)入載體pCzn1以達(dá)到高效表達(dá)的目的。研究結(jié)果顯示，優(yōu)化后的pCzn1-EMY162轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株DE3后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得了高產(chǎn)量的EMY162重組蛋白，與已有報(bào)道相一致。

外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)分為胞外分泌表達(dá)、周質(zhì)分泌表達(dá)和胞質(zhì)表達(dá)[5，11]。本實(shí)驗(yàn)取菌體用PBS混懸超聲破碎上清液，用8 M尿素混懸沉淀超聲破碎并收集上清液，經(jīng)SDS PAGE鑒定表達(dá)部位證實(shí)外源蛋白EMY162在包涵體中表達(dá)。大腸桿菌是最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，但目前發(fā)現(xiàn)外源蛋白在大腸桿菌表達(dá)中多以不可溶的包涵體蛋白形式存在，這是因?yàn)榘w蛋白更易得到無活性的蛋白，并且為得到最后有活性的蛋白做好了基礎(chǔ)，不過這需要經(jīng)過復(fù)雜的變復(fù)性過程。但相對(duì)于可溶蛋白而言，包涵體表達(dá)也具很多優(yōu)勢(shì)，比如包涵體蛋白利于純化、產(chǎn)量高，且目標(biāo)蛋白不易降解等。研究發(fā)現(xiàn)最適合大腸桿菌生長(zhǎng)的溫度一般為37 ℃～39 ℃，在此溫度下目的蛋白較其他溫度來說更易以包涵體形式存在，低溫條件一般約為8 ℃～10 ℃，外源蛋白以可溶蛋白表達(dá)比例較高。本實(shí)驗(yàn)采用15 ℃和37 ℃的溫度對(duì)大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，目的為觀察所導(dǎo)入的目的蛋白是以包涵體形式還是以可溶蛋白形式存在。經(jīng)SDS-PAGE電泳證明，15 ℃和37 ℃所表達(dá)的目的蛋白均以包涵體形式存在，并且37 ℃誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)量明顯高于15 ℃誘導(dǎo)，因此將大腸桿菌發(fā)酵溫度定為37 ℃。

多克隆抗體是通過抗原刺激機(jī)體，以此來產(chǎn)生免疫學(xué)的一系列反應(yīng)，該反應(yīng)是由機(jī)體的漿細(xì)胞參與完成，漿細(xì)胞可合成并分泌與抗原有特異性結(jié)合能力的免疫球蛋白[16]。本實(shí)驗(yàn)將提取純化后的目的蛋白EMY162作為抗原免疫新西蘭白兔，使機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，得到所需抗體。免疫完成后采血檢測(cè)，以間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，結(jié)果表明通過免疫制備得到的多克隆抗體效價(jià)較高。并且通過BCA蛋白濃度測(cè)定，均證實(shí)多克隆抗體制備成功，此研究為后續(xù)臨床病理“邊緣帶”的確定及發(fā)病機(jī)制研究提供了有利的工具。

目前WHO對(duì)于泡型包蟲病“邊緣帶”的界定及分期依照腫瘤的PNM評(píng)分原則，多層螺旋CT(MSCT)灌注成像[17]、18F-FDG PET/CT[20]和核磁共振[18，19]等影像學(xué)檢查方法及不同的序列對(duì)于泡型包蟲病邊緣帶的界定尚存在諸多爭(zhēng)議，病理學(xué)對(duì)于“邊緣帶”的界定依舊參考腫瘤邊緣帶炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的特點(diǎn)來劃分，尚缺乏臨床實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，這也是泡型包蟲病病人常見術(shù)后復(fù)發(fā)的重要原因之一。由于寄生蟲感染特征及致病的機(jī)制較腫瘤有較大差異，外源分泌型蛋白對(duì)于多房棘球蚴感染造成的損傷還缺乏相關(guān)的理論依據(jù)，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為多房棘球蚴感染所造成的嗜酸性粒細(xì)胞聚集是由病原體及相關(guān)分泌蛋白所引起。 日本學(xué)者Katoh Y等研究發(fā)現(xiàn)，EMY162蛋白質(zhì)以分泌蛋白形式存在并且在多房棘球蚴原頭蚴、續(xù)絳、幼蟲和成蟲階段都有高表達(dá)。本課題組選用EMY162蛋白為抗原制備抗體，旨在在后續(xù)研究中通過免疫組化法對(duì)多房棘球蚴感染病灶進(jìn)行研究，進(jìn)一步明確其病理特征。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了多房棘球蚴抗原EMY162原核表達(dá)系統(tǒng)載體，并獲得高純度蛋白后免疫新西蘭白兔，得到高純度、高效價(jià)多克隆抗體。

[1]Geramizadeh B，Baghernezhad M.Hepatic Alveolar Hydatid Cyst：A Brief Review of Published Cases from Iran in the Last 20 Years[J].Hepatitis Monthly，2016，16(10)：e38920.

[2]Kantarci M，Bayraktutan U，Karabulut N，et al.Alveolar echinococcosis：spectrum of findings at cross-sectional imaging[J].Radiographics A Review Publication of the Radiological Society of North America Inc，2012，32(7)：2053.

[3]Katoh Y，Kouguchi H，Matsumoto J，et al.Characterization of emY162 encoding an immunogenic protein cloned from an adult worm-specific cDNA library of Echinococcus multilocularis[J].Biochimica Et Biophysica Acta General Subjects，2008，1780(1)：1-6.

[4]Kouguchi H，Matsumoto J，Katoh Y，et al.The vaccination potential of EMY162 antigen against Echinococcus multilocularis infection[J].Biochemical & Biophysical Research Communications，2007，363(4)：915-920.

[5]李潤(rùn)樂，康明，湯鋒，等.肝片吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白2(FhSAP-2)的原核表達(dá)及分離純化[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，35(1)：46-51.

[6]孫楠.茶樹核糖體失活蛋白抗病毒功能研究[D].河南：信陽師范學(xué)院，2014.

[7]馬寧.一個(gè)新的冷誘導(dǎo)茶樹CBF基因的克隆與功能分析[D].河南：信陽師范學(xué)院，2015.

[8]宋愈佳.刺參半胱氨酸蛋白酶抑制劑特性及其在自溶中的變化規(guī)律研究[D].遼寧：大連工業(yè)大學(xué)，2015.

[9]鄭金鼎.艾滋病合并隱球菌病或合并馬爾尼菲青霉菌病的研究[D].湖北：武漢大學(xué)，2015.

[10]孫影.柞蠶空胴病病原菌基因組、侵染后柞蠶蛋白質(zhì)組及柞蠶免疫Toll通路研究[D].遼寧：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[11]李潤(rùn)樂.新型肝片吸蟲多表位疫苗的研究[D].青海：青海大學(xué)，2015.

[12]MF-M，Danon T，Christian T，et al.Genes adopt non-optimal codon usage to generate cell cycle-dependent oscillations in protein levels[J].Molecular Systems Biology，2012，8(1)：572.

[13]Yang H，Liu L，Shin HD，et al.Comparative analysis of heterologous expression，biochemical characterization optimal production of an alkaline α-amylase from alkaliphilic Alkalimonas amylolytica in Escherichia coli and Pichia pastoris[J].Biotechnology Progress，2013，29(1)：39-47.

[14]趙洋，楊陽，劉振，等.茶樹密碼子用法分析[J].茶葉科學(xué)，2011，31(4)：319-25.

[15]何艷嫦，鐘俊東.兔抗人血清制備與效價(jià)的鑒定[J] .國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32(18)：2109-2110.

[16]姚冰，劉文亞，王靜，等.肝臟泡狀棘球蚴病邊緣區(qū)域的MSCT灌注成像研究[J] .新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(4)：375-378.

[17]李肖紅.肝泡型包蟲病邊界的～(18)F-FDG生物學(xué)特征與臨床研究[D].新疆：新疆醫(yī)科大學(xué)，2015.

[18]馬娟，王金英，王儉，等.磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像ADC、EADC腦泡型包蟲病邊緣帶定量分析[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，31(11)：1347-1350.

[19]康琦，劉海霞，鮑海華.DWI及ADC值測(cè)量在肝泡型包蟲病診斷中的應(yīng)用新進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志，2015，9：1667-16679.