轉(zhuǎn)錄組學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀*

高寧，劉博，楊德強(qiáng)，蘇曉琳，王蒙，匡海學(xué)*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江農(nóng)墾職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025）

轉(zhuǎn)錄組學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀*

高寧1，劉博2，楊德強(qiáng)1，蘇曉琳1，王蒙1，匡海學(xué)1*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150040；2.黑龍江農(nóng)墾職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025）

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究在特定條件下細(xì)胞全部轉(zhuǎn)錄本的學(xué)科。其能夠全面檢測分析基因表達(dá)與調(diào)控規(guī)律，尤其適合于以多成分、多靶點(diǎn)為特點(diǎn)的中藥學(xué)研究。本文介紹了轉(zhuǎn)錄組學(xué)常用研究方法并對(duì)其在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)研究人員提供參考。

基因芯片；高通量測序；分子機(jī)理

人類基因組計(jì)劃的順利完成以及生物科技的迅速發(fā)展使得現(xiàn)代生物醫(yī)藥研究進(jìn)入了后基因組時(shí)代，功能基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)以及多組學(xué)聯(lián)合的系統(tǒng)生物學(xué)等眾多新興概念及研究手段隨之涌現(xiàn)出來，使得生物醫(yī)藥研究得到了空前的發(fā)展并取得了極大的進(jìn)步。特別是，“組學(xué)（-omic）”概念的提出及相應(yīng)技術(shù)的發(fā)展，使得研究對(duì)象不再局限于單一的生物分子及通路，而是能夠同時(shí)檢測上萬個(gè)靶點(diǎn)并從整體分析研究對(duì)象基因、蛋白、代謝產(chǎn)物、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等的改變，全面掌握疾病發(fā)生發(fā)展及藥物的作用機(jī)理。其中轉(zhuǎn)錄組學(xué)是在整體水平研究細(xì)胞中所有基因轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。中醫(yī)藥是我國文化瑰寶，是我國對(duì)世界醫(yī)學(xué)界的重要貢獻(xiàn)，也是我國醫(yī)療衛(wèi)生體系的組成部分。中醫(yī)藥作用機(jī)理研究一直是中醫(yī)藥研究的關(guān)鍵，是中醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)也是難點(diǎn)。其難點(diǎn)在于，中醫(yī)藥理論多以機(jī)體整體表現(xiàn)進(jìn)行病癥的描述，中藥方劑也多以復(fù)方入藥，所含化學(xué)成分復(fù)雜，各成分所對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)相互協(xié)作、相互調(diào)節(jié)共同發(fā)揮藥理藥效達(dá)到治療病癥的目的。因此，傳統(tǒng)的單一基因及蛋白的研究手段難以從整體掌握中醫(yī)藥的作用機(jī)理，不宜發(fā)掘其內(nèi)在本質(zhì)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究則能夠全面反映出機(jī)體對(duì)于外界刺激的內(nèi)在變化，其研究及分析策略也與傳統(tǒng)中醫(yī)藥不謀而合，因此，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究在中醫(yī)藥領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了較好的成果，本文對(duì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究手段及其在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)，以期為相關(guān)研究人員提供參考。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)

1.1 基因芯片[1]

基因芯片又稱DNA芯片，其是將數(shù)以萬計(jì)的核酸探針按一定的排列方式集中固定在載體上制備而成。每一條探針都對(duì)應(yīng)特定的基因序列，用以檢測樣本中特定基因的表達(dá)豐度。基因芯片在應(yīng)用時(shí)，首先，需提取待測對(duì)象DNA或RNA，純化后經(jīng)擴(kuò)增、熒光標(biāo)記制備成為可用于雜交的cRNA樣品，處理后的樣品與芯片上的探針雜交，洗脫后掃描得到基因芯片雜交信號(hào)圖像，隨后提取掃描信號(hào)轉(zhuǎn)換為雜交信號(hào)強(qiáng)度，比較各組信號(hào)強(qiáng)度差異得到轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化。最后利用生物信息技術(shù)分析轉(zhuǎn)錄組表達(dá)變化的生物學(xué)意義。

1.2 高通量測序[2]

高通量測序又被稱為下一代測序技術(shù)，其主要采用邊合成邊測序的策略。與傳統(tǒng)的Sanger測序相比，高通量測序技術(shù)能夠一次對(duì)幾十萬到幾百萬條核苷酸序列進(jìn)行測定，結(jié)合生物信息分析，極大地推動(dòng)了基因組與轉(zhuǎn)錄組的研究進(jìn)程。典型代表包括Roche公司推出的454焦磷酸測序平臺(tái)、Illumina公司的Solexa測序平臺(tái)以及ABI公司的Solid測序平臺(tái)。

1.3 單分子測序[3]

隨著測序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，目前已開發(fā)出第三代測序技術(shù)，相對(duì)于早期的高通量測序，第三代技術(shù)讀長更長、運(yùn)行速度更快、能夠直接對(duì)RNA和甲基化的DNA測序，其顯著特點(diǎn)即為直接利用單分子測序，無需經(jīng)過PCR擴(kuò)增過程。單分子測序技術(shù)目前包括Helicos單分子測序技術(shù)、Pacific Bioscience的SMRT技術(shù)以及Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測序技術(shù)。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)在中藥學(xué)研究中的應(yīng)用

2.1 中藥基原植物的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，能夠從整體水平掌握基因表達(dá)與調(diào)控規(guī)律，深入開展中藥基源植物的轉(zhuǎn)錄組研究有助于揭示中藥有效成分形成機(jī)制，闡明中藥材道地性形成原因，為藥用植物育種提供參考。因此，中藥基原植物的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究受到中藥研究人員的廣泛重視及關(guān)注。Rai等[4]對(duì)金銀花的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了研究。研究人員分別從莖尖、莖、基生葉、次生葉、成熟葉片、綠色花蕾、白色花蕾、白色花以及紅色花等不同發(fā)育時(shí)期共計(jì)9個(gè)組織部位取樣提取RNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共得到243185條unigene，其中99938條unigene獲得注釋信息，其中與綠原酸、木犀草素、裂環(huán)烯醚萜生物合成途徑相關(guān)的同源基因均被鑒定獲得。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與綠原酸有關(guān)的unigene富集于莖及次生葉，與木犀草素有關(guān)的unigene富集于莖與花，而裂環(huán)烯醚萜代謝過程則主要富集于基生葉與莖尖，表明不同組織部位其有效成分的組成存在差異，在藥物應(yīng)用過程中需提起注意。周茜等[5]應(yīng)用Illumina Hiseq 2000測序平臺(tái)對(duì)北葶藶子進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，共注釋得到27935條unigene，進(jìn)一步分析篩選得到了534條參與獨(dú)行菜次生代謝產(chǎn)物合成途徑的基因，其中參與芥子苷合成途徑的基因4條、參與黃酮類合成的19條、參與芪類化合物合成的69條、參與苯丙氨酸代謝的92條。同時(shí)還得到了6304個(gè)SSR位點(diǎn)，其研究結(jié)果為葶藶子藥效成分生物合成途徑的研究提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)信息。Xu等[6]在前期研究的基礎(chǔ)上，聯(lián)合運(yùn)用了高通量測序（NGS）與單分子實(shí)施測序技術(shù)（SMAT）對(duì)丹參各部分根組織進(jìn)行了分析，深入了解丹參轉(zhuǎn)錄組，為進(jìn)一步了解其有效成分丹參酮的生物合成提供了實(shí)驗(yàn)參考，并發(fā)現(xiàn)丹參酮的產(chǎn)生與積累過程主要發(fā)生在根皮部位。Liu等[7]利用454GS FLX測序平臺(tái)對(duì)膜莢黃芪進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序并建立表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)位點(diǎn)，得到9893個(gè)unigene并對(duì)其進(jìn)行了GO注釋以及KEGG pathway分析，分析表明所得序列共涉及34個(gè)GO語義以及46條生物化學(xué)途徑，其結(jié)果為研究黃芪有效成分合成途徑、黃芪基原植物分類鑒定、分子育種等提供了分子基礎(chǔ)。其他如人參、虎杖、杜仲等幾十種藥用植物也均進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序與分析[8]，為進(jìn)一步了解掌握中藥材特性，開發(fā)藥用資源奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2.2 中藥藥效作用機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

中藥具有多成分多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，單一的基因、蛋白及信號(hào)分析往往難以準(zhǔn)確把握中藥藥效的分子機(jī)理。而轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法能夠全面掌握機(jī)體整體基因表達(dá)調(diào)控變化，因此，一直受到中醫(yī)藥研究人員的青睞，并廣泛應(yīng)用于中藥藥效研究。周嵐等[9]以ApoE基因敲除小鼠作為模型，利用基因芯片分別檢測活血中藥（川芎、當(dāng)歸）與破血中藥（三棱、莪術(shù)）對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的治療作用并探討其分子機(jī)理。結(jié)果表明，與模型組相比，活血藥組及破血藥組中動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因Cxcr4、Alox12、Alox5ap、VcamI基因表達(dá)下調(diào)，而Ccr5、Cxcl12、Cxcl16、LCAT表達(dá)上調(diào)。差異基因主要涉及炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞粘附、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程以及TGF-β、MAPK、Jak-STAT、NF-κB等信號(hào)通路，證明動(dòng)脈粥樣硬化為多因素影響的復(fù)雜病變過程，而4種中藥可能是通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因、內(nèi)皮系統(tǒng)相關(guān)基因以及脂代謝相關(guān)基因進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的。張喆等[10]利用基因芯片技術(shù)考察了貝母乙素對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞基因表達(dá)的影響。通過比較分析，共篩選出37條差異基因，共涉及尿嘧啶核苷代謝過程、熱生成調(diào)控、脂肪代謝與調(diào)控腎上腺素能受體信號(hào)途徑、G蛋白歐聯(lián)受體信號(hào)途徑等生物學(xué)過程以及嘧啶帶系誒、酮體和成績降解、VB6代謝等生物學(xué)通路，表明貝母乙素能夠影響HCT-116細(xì)胞的嘧啶代謝，抑制細(xì)胞增殖，為揭示其抗腫瘤作用機(jī)理并指導(dǎo)臨床應(yīng)用提供參考。Qu等[11]以MCF-7細(xì)胞系為模型，考察苦參注射液抗腫瘤作用機(jī)理。結(jié)果表明苦參注射液能夠抑制細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且具有劑量依賴性。多條生物學(xué)途徑受到擾亂，苦參注射液可能是通過p53途徑間接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的。另外，Qu等還堅(jiān)定了多條與苦參注射液治療相關(guān)的lncRNA，為揭示苦參注射液抗腫瘤作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。Zhou等[12]以卵巢癌SKOV3細(xì)胞系為研究對(duì)象，考察了掌葉半夏提取物抗卵巢癌的作用并利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測給藥前后SKOV3細(xì)胞基因表達(dá)變化情況。結(jié)果表明，掌葉半夏提取物能夠誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡，且存在劑量依賴性與時(shí)間按依賴性。比較給藥組與空白組細(xì)胞基因表達(dá)差異也發(fā)現(xiàn)，差異基因主要涉及稀薄啊凋亡過程及類固醇的生物合成，表明掌葉半夏提取物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是伴隨類固醇生物合成的，也為掌葉半夏提取物用于卵巢癌治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2.3 中藥復(fù)方藥理作用機(jī)理的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

中藥臨床應(yīng)用多以復(fù)方入藥，其功效并不是單純的各藥相加，而是通過一定的配伍、相互作用協(xié)同發(fā)揮藥效，因此其機(jī)制更為復(fù)雜，研究難度更大，而轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)則為中藥復(fù)方作用機(jī)理研究提供了新的手段，并取得了較好的應(yīng)用成果。Wang等[13]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)開展了芪參益氣方對(duì)大鼠急性心肌梗塞的治療作用研究。結(jié)果表明，芪參益氣方能夠改善大鼠心室重構(gòu)過程從而緩解心肌梗塞癥狀。同時(shí)通過功能群分析發(fā)現(xiàn)芪參益氣方能夠影響兩個(gè)重要的心血管疾病信號(hào)通路：促進(jìn)NO水平并抑制花生四烯酸氧合酶途徑從而發(fā)揮抗炎作用以及通過脂肪酸氧化調(diào)節(jié)血脂異常，表明芪參益氣方能夠通過多種途徑發(fā)揮治療心肌梗塞的效果。Gao等[14]利用基因芯片技術(shù)研究了腎康顆粒對(duì)慢性腎小球腎炎大鼠基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與模型組相比，給藥組大鼠Pnoc、Cacfd1、Fos、Igll1、Lcn2及Syk基因表達(dá)顯著下調(diào)，而Cyp2c7、Hsd3b6、Acsm5與Ugt2b15基因表達(dá)顯著上調(diào)。生物學(xué)途徑方面細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的外源化合物代謝過程、B細(xì)胞受體信號(hào)途徑、趨化因子及其受體相互作用等過程受到抑制，而免疫應(yīng)答、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期與細(xì)胞粘連等生物學(xué)功能也受到影響。然而腎康顆粒藥效作用分子機(jī)制尚需進(jìn)一步考察。Chang等[15]以MLC901細(xì)胞為對(duì)象，研究了丹芪膠囊對(duì)人神經(jīng)祖細(xì)胞基因表達(dá)的影響，探討丹芪膠囊調(diào)節(jié)神經(jīng)再生及其神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)理，并發(fā)現(xiàn)FGF19、GALR2、MMP10、FGF3與TDO2可能是丹芪膠囊藥效作用靶點(diǎn)。胡晶晶等[16]利用基因芯片技術(shù)研究了中藥復(fù)方麝香保心丸與雙龍方治療心肌梗死的藥效機(jī)制。結(jié)果共篩選得到224條差異基因，聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組復(fù)方均能夠回調(diào)因心肌梗死而發(fā)生表達(dá)紊亂的差異基因，說明雙龍方與麝香保心丸均具有治療心肌梗死的作用，且機(jī)制相似。對(duì)差異基因參與的生物學(xué)功能及代謝通路分析結(jié)果顯示，富集顯著的功能包括甘油三磷酸脫氫酶活性、NAD結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合等分子功能，差異基因參與的代謝通路則包括糖酵解、間隙連接、MAPK信號(hào)通路等。推測麝香保心丸與雙龍方可能是通過改善大鼠心肌能量代謝異常進(jìn)而治療心肌梗死的。

3 展望

中醫(yī)藥以上千年的傳承及臨床實(shí)踐證明其在疾病治療方面的確切功效，受到廣大患者的一致認(rèn)可。然而，與之相對(duì)應(yīng)的是，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度來看，中醫(yī)藥治病機(jī)理仍未得到良好闡述，特別是中藥多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)使得其藥效作用機(jī)制成為研究難點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)及迅速發(fā)展，為中醫(yī)藥研究提供了全新的研究手段并展現(xiàn)了良好的研究預(yù)期，其全面檢測、綜合分析的特點(diǎn)很好的切合了中醫(yī)藥的理論思想，因此，越來越受到廣大中醫(yī)藥研究工作者的青睞，并取得了一定的研究成果。相信隨技術(shù)的進(jìn)步、應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)必將在中醫(yī)藥研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，為中醫(yī)藥理論提供實(shí)驗(yàn)支持，擴(kuò)大中醫(yī)藥在世界范圍的影響力，實(shí)現(xiàn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化。

［1］劉天龍，李玉文，張一愷，等.基因芯片技術(shù)在中藥藥理作用機(jī)制研究中的應(yīng)用［J］.中國藥房,2016，（28）:4021-4024.

［2］張曉萌，李健春，王瓊，等.轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.中國現(xiàn)代中藥,2016，18（8）:1084-1087.

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［9］周嵐,李楊,汪典,等.利用基因芯片分析活血中藥、破血中藥對(duì)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的差異表達(dá)基因

Current situation of transcriptome research on traditional Chinese medicine*

GAO Ning1,LIU Bo2,YANG De-qiang1,SU Xiao-lin1,WANG Meng1,KUANG Hai-xue1*
（1.Key Laboratory of Chiense Materia Medica（Ministry of Education）,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;2.Heilongjiang Nongken Vocational College,Harbin 150025,China）

The transcriptome is the set of all messenger RNA molecules in one cell or a population of cells. Transcritomics is the subject of studying the regulation of gene expression.It is suitable for researching on the molecular mechanism of tranditional Chinese medicine which has multi components and targets.This paper review the methods of transcripomics and its application in the research on Chinese medicine,in order to provide reference for researchers.

DNA microarray;high-throughput sequencing;molecular mechanism

R5

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170650

2017-03-27

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81503271）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)校基金面上項(xiàng)目（No.201012）；黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育教學(xué)研究基金項(xiàng)目（XJJ2014047）

高寧（1982-），男，講師，在讀博士研究生，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

匡海學(xué)（1955-），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥性味理論及中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。