血清HBV RNA檢測(cè)的臨床價(jià)值

劉瑞霞， 潘修成， 耿 建

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 感染科， 江蘇 徐州 221000)

綜述

血清HBV RNA檢測(cè)的臨床價(jià)值

劉瑞霞， 潘修成， 耿 建

(徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 感染科， 江蘇 徐州 221000)

目前雖有多種用于評(píng)價(jià)抗HBV療效的指標(biāo)，但其總體準(zhǔn)確性和敏感性仍不高，仍需要新的評(píng)估指標(biāo)用于指導(dǎo)臨床。近幾年研究發(fā)現(xiàn)HBV RNA可能是一種具有潛在用于臨床檢測(cè)價(jià)值的新指標(biāo)。就HBV RNA的基本概念、檢測(cè)方法及在臨床診斷中的價(jià)值等方面做一綜述。

肝炎病毒, 乙型; RNA, 病毒; 生物學(xué)標(biāo)記; 綜述

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者。每年約有65萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)[1]。目前應(yīng)用于抗HBV的口服藥物如恩替卡韋、拉米夫定等雖可通過抑制HBV的反轉(zhuǎn)錄快速清除包含HBV DNA的HBV顆粒，有效降低外周HBV DNA載量[2-3]，但對(duì)肝細(xì)胞核內(nèi)的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)無明確作用，即使核苷和核苷酸類藥物(NAs)治療至血清HBV DNA陰性，停藥后大多終將復(fù)發(fā)，且長期應(yīng)用易耐藥；IFNα在相對(duì)年輕的患者(包括青少年患者)、預(yù)期在短期內(nèi)完成治療、希望近年內(nèi)生育及首次治療等患者中做為優(yōu)先選擇，但對(duì)于處于失代償期肝硬化、自身免疫性疾病、甲狀腺功能疾患及精神神經(jīng)異常等患者中不宜使用，且長期應(yīng)用有導(dǎo)致骨髓抑制、誘發(fā)自身免疫性疾病等可能。目前應(yīng)用于臨床的監(jiān)測(cè)抗HBV療效的指標(biāo)如HBsAg、HBeAg、HBV DNA都很難準(zhǔn)確反映肝臟的病情進(jìn)展及預(yù)后，故急需尋找一種靈敏度高且可反映疾病狀態(tài)的血清學(xué)指標(biāo)。近期研究發(fā)現(xiàn)，血清HBV RNA與HBV感染狀態(tài)、病情進(jìn)展及HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換等方面關(guān)系密切，有望被用于臨床檢測(cè)。

1 HBV RNA的概念及檢測(cè)方法

HBV屬嗜肝科DNA病毒，基因組包括部分雙鏈和長度不等的單鏈，大約3200 bp。在HBV感染過程中，HBV侵入人的肝細(xì)胞，脫去核殼形成松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)，rcDNA進(jìn)入肝細(xì)胞核中依賴HBV編碼的的DNA聚合酶補(bǔ)齊兩條鏈上的缺口，形成超螺旋結(jié)構(gòu)的cccDNA，并以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄為不同大小的mRNA(3.5 kb、2.4 kb、2.1 kb、0.7 kb)，從而翻譯各種病毒蛋白。其中3.5 kb的mRNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板，利用病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶合成全長的基因組負(fù)鏈DNA，再以負(fù)鏈DNA作為模板，通過病毒DNA聚合酶的作用，合成正鏈DNA，與負(fù)鏈DNA一起組成新的HBV rcDNA。新合成的HBV rcDNA一方面進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，轉(zhuǎn)化為新的cccDNA，補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)的cccDNA庫，另一方面與病毒蛋白裝配成新的完整HBV，釋放至細(xì)胞外，再感染健康的肝細(xì)胞[4]。因此肝細(xì)胞核內(nèi)cccDNA的存在為目前乙型肝炎治療的難點(diǎn)。早在1996年，Kock等[5]已經(jīng)在慢性HBV感染者的血清中檢測(cè)到了HBV RNA。盡管已有許多關(guān)于外周血HBV RNA存在的報(bào)道，但哪些部分屬于HBV RNA仍不清楚。Tanaka等[6]應(yīng)用蔗糖梯度離心法發(fā)現(xiàn)HBV RNA與HBcAg、HBV DNA結(jié)構(gòu)相似，證實(shí)病毒顆粒中HBV RNA的存在。Su等[7]研究表明了血清中不同HBV轉(zhuǎn)錄體的存在及意義，提供了研究循環(huán)HBV RNA的常規(guī)PCR檢測(cè)方法。但現(xiàn)已有實(shí)驗(yàn)[8]證實(shí)，檢測(cè)血清中的HBV RNA為前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)，即3.5 kb mRNA(大于基因組全長3.2 kb)，其來源可能為核衣殼包裹的pgRNA在未啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄步驟的情況下直接獲得包膜并從感染的肝細(xì)胞中釋放出來。理論上講，帶有病毒外膜的HBV RNA病毒樣顆粒同樣具有感染性，可以通過鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白和硫酸乙酰蛋白聚糖的介導(dǎo)感染肝細(xì)胞。目前用于檢測(cè)血清HBV RNA的方法主要為實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法(RT-PCR)。

2 臨床上的應(yīng)用價(jià)值

2.1 HBV RNA與HBV cccDNA的關(guān)系 HBV cccDNA是HBV復(fù)制的模板，目前抗病毒治療難以清除HBV cccDNA，也是停藥后容易復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。但是，HBV cccDNA檢測(cè)難以廣泛開展，其重要原因就是需要進(jìn)行肝組織穿刺有創(chuàng)檢查，而在臨床上患者難以接受，且不適合對(duì)肝移植、造血干細(xì)胞移植后及進(jìn)行細(xì)胞化療的慢性乙型肝炎(CHB)患者病情進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)[9]，而血清HBV RNA的檢測(cè)取材簡單、無創(chuàng)，更易被患者所接受。近期Lu等[10]通過對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠及CHB患者血清進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在血清總HBV RNA中，占主導(dǎo)地位的主要為3.5 kb HBV RNA(前核心mRNA和pgRNA)，其中血清中檢測(cè)到的主要為pgRNA，它的存在與病毒的持續(xù)感染及停用抗HBV藥物后的病毒學(xué)復(fù)發(fā)有關(guān)。研究顯示，在轉(zhuǎn)基因鼠內(nèi)應(yīng)用恩替卡韋抗HBV治療后HBV RNA水平反而升高，而CHB患者中血清HBV RNA隨治療時(shí)間的延長其水平下降，但下降較慢。且該研究亦發(fā)現(xiàn)33個(gè)CHB患者在治療結(jié)束時(shí)其HBV DNA均小于檢測(cè)值下限，但是21例患者pgRNA仍能檢測(cè)到，隨訪至停藥后24周發(fā)現(xiàn)，21例pgRNA陽性患者均發(fā)生病毒學(xué)復(fù)發(fā)。研究者分析認(rèn)為因pgRNA由感染肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，因此理論上血清HBV RNA病毒樣顆粒的存在及水平能夠反映cccDNA的狀態(tài)(包括cccDNA存在水平及其轉(zhuǎn)錄活性)。研究[10]證明，核衣殼包裹的來自cccDNA的pgRNA可以RNA病毒樣顆粒的形式釋放，其過程不為NAs治療所阻斷，故當(dāng)血清中檢測(cè)不到HBV RNA時(shí)，提示患者肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的消失或者轉(zhuǎn)錄靜默，預(yù)示著可以安全停藥[11-12]。

近期Lu等[13]進(jìn)一步研究了HBV RNA與cccDNA的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA可反映肝細(xì)胞cccDNA活性。該項(xiàng)研究納入84例慢性HBV感染初治患者，包括62例HBeAg陽性和22例HBeAg陰性患者，以及41例接受NAs治療至少2年的CHB患者隊(duì)列，研究結(jié)果表明HBeAg陽性患者的血清HBV RNA水平與肝內(nèi)cccDNA呈顯著相關(guān)，但HBeAg陰性患者的血清HBV RNA水平與肝內(nèi)cccDNA無相關(guān)性。此外，血清HBV RNA聯(lián)合HBV DNA水平，可用于反映cccDNA活性，準(zhǔn)確性優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用血清HBV RNA或HBV DNA。在接受NAs治療的CHB患者中，沒有觀察到血清HBV RNA水平與肝內(nèi)ccc DNA之間的定量相關(guān)性，但統(tǒng)計(jì)分析顯示，血清HBV RNA水平可以反映CHB患者的肝內(nèi)cccDNA狀態(tài)。研究者分析認(rèn)為HBeAg狀態(tài)可影響血清HBV RNA與cccDNA的相關(guān)性，HBV RNA與HBV DNA的聯(lián)合應(yīng)用能較好的反映肝細(xì)胞核內(nèi)cccDNA活性。

Giersch等[12]主要探究血清pgRNA與肝內(nèi)pgRNA及cccDNA載量間的聯(lián)系及評(píng)估NAs和IFNα對(duì)血清HBV pgRNA的影響。在對(duì)23例HBV感染的小鼠中發(fā)現(xiàn)血清pgRNA與肝內(nèi)pgRNA顯著相關(guān)，且這種相關(guān)性在NAs或者IFNα治療時(shí)均成立。另一方面，在未應(yīng)用藥物治療的HBV感染的小鼠中發(fā)現(xiàn)血清pgRNA與cccDNA亦顯著相關(guān)，但這種相關(guān)性在IFNα治療過程中不明顯。Tsuge等[14]對(duì)36例應(yīng)用NAs治療的CHB患者的研究發(fā)現(xiàn)，停止藥物治療后19例患者出現(xiàn)HBV DNA復(fù)發(fā)，分析發(fā)現(xiàn)治療3個(gè)月時(shí)HBV DNA+RNA的水平與停止藥物治療后的HBV DNA復(fù)發(fā)相關(guān)，監(jiān)測(cè)此時(shí)間點(diǎn)的DNA+RNA水平可預(yù)測(cè)停止NAs治療后CHB患者的肝臟炎癥再活動(dòng)。以上研究結(jié)果提示血清pgRNA可作為cccDNA存在的穩(wěn)定的血清學(xué)標(biāo)志物。

2.2 預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換中的應(yīng)用 對(duì)于接受抗HBV治療的HBeAg陽性CHB患者而言，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換是首要治療終點(diǎn)，也是實(shí)現(xiàn)免疫控制的標(biāo)志。Bartens等[15]對(duì)62例CHB患者分析發(fā)現(xiàn)，50例HBeAg陽性的CHB患者在應(yīng)用NAs治療后，15例發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換[發(fā)生時(shí)間為治療后(19±14)個(gè)月]，并發(fā)現(xiàn)在治療后的3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)HBV RNA下降水平能較強(qiáng)的預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。另一項(xiàng)來自Berg等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，17例初始應(yīng)用阿德福韋酯治療部分應(yīng)答或無應(yīng)答的CHB患者改為口服替諾福韋酯治療，治療結(jié)束時(shí)11例HBeAg陽性CHB患者中5例出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，在對(duì)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換與未轉(zhuǎn)換組的比較分析發(fā)現(xiàn)，除基線水平外，在治療12、24、48周時(shí)間點(diǎn)發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換組HBV RNA水平均明顯低于未轉(zhuǎn)換組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究者認(rèn)為，在應(yīng)用NAs治療過程中，血清HBV RNA水平或可作為預(yù)測(cè)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的血清學(xué)標(biāo)志物。

2.3 不同治療藥物對(duì)血清HBV RNA的影響 目前應(yīng)用于抗HBV的藥物主要有NAs及IFN兩大類， IFNα與NAs相比具有療程固定、不產(chǎn)生病毒耐藥、HBsAg和HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率高且應(yīng)答持久等優(yōu)點(diǎn)[17-18]。對(duì)于HBV DNA的抑制方面，NAs主要通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性來減少新生HBV顆粒，而IFN無法發(fā)揮直接抗病毒作用，其主要通過與IFN受體結(jié)合后產(chǎn)生具有抗病毒作用的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用[19]。目前一些研究[20-21]證明拉米夫定序貫聯(lián)合IFN治療較拉米夫定單藥治療效果更佳，如可增加HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率，較高的ALT復(fù)常率、HBV DNA轉(zhuǎn)陰率，以及減少停藥后復(fù)發(fā)率等。再者，在IFNα治療之前應(yīng)用拉米夫定治療可以提高持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率[22]。然而關(guān)于此種結(jié)果的作用機(jī)制仍不清楚，仍需進(jìn)一步研究。在對(duì)血清HBV RNA的影響方面兩者亦存在差異。Chayama等[23]對(duì)19例CHB患者進(jìn)行分析，治療前HBV RNA均小于檢測(cè)下限，但治療結(jié)束時(shí)及隨訪過程中發(fā)現(xiàn)NAs單藥治療組所有患者HBV RNA均被檢測(cè)到，但序貫聯(lián)合治療組中無1例患者被檢測(cè)到。研究者認(rèn)為對(duì)于NAs治療HBV感染后血清HBV RNA可被檢測(cè)到，IFNα治療可能通過抑制HBV RNA復(fù)制中間體的形式來減少HBV DNA復(fù)制，最終導(dǎo)致HBV RNA不可測(cè)。Dienstag等[24]研究表明，NAs序貫IFN時(shí)雖可抑制HBV RNA，但它抑制HBV DNA復(fù)制時(shí)較NAs作用弱。Wieland等[25]研究證明IFNα/β抑制衣殼包涵體pgRNA水平是通過加速其降解或抑制其合成實(shí)現(xiàn)的。

Doong等[26]證明在拉米夫定等NAs治療后的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中HBV相關(guān)RNA水平未下降。Giersch等[12]的研究亦發(fā)現(xiàn)，在5例HBV感染的USB小鼠中,應(yīng)用NAs治療4周后血清HBV pgRNA水平較基線水平稍增加，而IFNα在治療4周后較基線水平明顯下降。但此研究未在CHB患者中進(jìn)行。與以上兩項(xiàng)研究不同的是，Berg等[16]報(bào)道，在應(yīng)用替諾福韋酯治療后血清HBV RNA隨治療時(shí)間的延長其水平逐漸減低，Takahashi等[27]的研究也表明在應(yīng)用拉米夫定或恩替卡韋治療過程中，隨治療時(shí)間的延長血清HBV RNA水平逐漸下降。NAs對(duì)HBV RNA不同結(jié)果的原因考慮與治療時(shí)間長短不同有關(guān)。

2.4 血清HBV RNA與病毒學(xué)應(yīng)答的關(guān)系 Takahashi等[27]對(duì)52例應(yīng)用NAs治療的CHB患者進(jìn)行研究，分別檢測(cè)基線、治療12周和24周時(shí)血清HBV RNA水平，HBV DNA每4～12周檢測(cè)1次以便用于定義初始的病毒學(xué)應(yīng)答(即HBV DNA首次小于檢測(cè)值下限)，研究發(fā)現(xiàn)16周前發(fā)生首次病毒學(xué)應(yīng)答者其12周時(shí)的血清HBV RNA水平小于16周后發(fā)生首次病毒學(xué)應(yīng)答者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果提示12周時(shí)的血清HBV RNA水平可作為一獨(dú)立影響因素來預(yù)測(cè)初始的病毒學(xué)應(yīng)答。

Jansen等[28]對(duì)106例CHB 患者進(jìn)行研究，20例患者應(yīng)用NAs單藥治療，86例患者應(yīng)用IFNα聯(lián)合阿德福韋酯治療，研究發(fā)現(xiàn)在治療過程中聯(lián)合治療組較NAs單藥治療組血清HBV RNA水平下降更明顯，且這種差異在治療應(yīng)答者組與未應(yīng)答者組中亦成立。在HBeAg陰性CHB患者中，較低的基線血清HBV RNA水平可作為IFNα聯(lián)合阿德福韋酯治療過程中發(fā)生病毒學(xué)應(yīng)答的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。研究者認(rèn)為，與抗病毒治療過程中已經(jīng)建立的血清標(biāo)志物指標(biāo)不同，血清HBV RNA可能會(huì)做為評(píng)估CHB患者抗HBV治療過程中的另一潛在有效指標(biāo)。

此外，Hayashi等[29]對(duì)HBV pgRNA、cccDNA的定量與HBV相關(guān)HCC的關(guān)系進(jìn)行了研究。共納入38例HCC患者，包括14例HBsAg陽性患者和24例HBsAg陰性但抗-HBc陽性的患者(在這24例患者中有20例HBV DNA大于檢測(cè)下限)。結(jié)果表明pgRNA與cccDNA的復(fù)制不僅存在于HBsAg陽性患者中，隱匿性HBV感染者中亦存在；再者，肝癌組織中的pgRNA與cccDNA水平與非肝癌組織中無明顯差異。Hiraga等[30]研究亦發(fā)現(xiàn)檢測(cè)拉米夫定治療12周時(shí)HBV RNA水平可預(yù)測(cè)YMDD突變的發(fā)生，或?qū)⒆鳛轭A(yù)測(cè)拉米夫定治療過程中是否發(fā)生耐藥的新指標(biāo)。

3 血清HBV RNA與HBV DNA、HBsAg的比較

《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[1]中對(duì)病毒學(xué)應(yīng)答的定義為治療過程中，血清HBV DNA低于檢測(cè)下限。并對(duì)HBeAg陽性CHB患者應(yīng)用NAs治療療程提出建議，建議總療程至少4年，在達(dá)到HBV DNA低于檢測(cè)下限、ALT復(fù)常、HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換后，再鞏固治療至少3年(每隔6個(gè)月復(fù)查1次)仍保持不變者，可考慮停藥，但延長療程可減少復(fù)發(fā)[31-34]。但是血清HBV DNA小于檢測(cè)下限僅代表了病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程被抑制，并不能反映cccDNA的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，因逆轉(zhuǎn)錄過程被抑制后，有轉(zhuǎn)錄活性的cccDNA仍會(huì)以HBV RNA病毒樣顆粒的方式產(chǎn)生子代病毒，這就解釋了為什么以現(xiàn)有病毒學(xué)應(yīng)答為前提條件停藥后病毒學(xué)反彈和復(fù)發(fā)率較高了。與血清HBV DNA相比，HBV RNA在監(jiān)測(cè)持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答及肝細(xì)胞核內(nèi)cccDNA池的耗竭方面占優(yōu)勢(shì)。因此近期魯鳳民等[35]提出了全新的病毒學(xué)應(yīng)答概念：在治療過程中血清HBV DNA與HBV RNA均小于檢測(cè)下限。

血清HBsAg與HBV RNA相比亦不能反映肝細(xì)胞核內(nèi)cccDNA的狀態(tài)。血清中的HBsAg主要來自肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA[36]，但現(xiàn)有較多的實(shí)驗(yàn)表明整合的HBV DNA片段亦能轉(zhuǎn)錄翻譯出HBsAg，慢性HBV感染者帶有HBV整合片段的肝細(xì)胞最高可占肝細(xì)胞總數(shù)的1%，因此，HBV基因的整合很可能是導(dǎo)致HBsAg清除在臨床上難以實(shí)現(xiàn)的另外一個(gè)原因，從這個(gè)角度來講，HBsAg不是一個(gè)理想的評(píng)價(jià)臨床治愈的指標(biāo)。另外，關(guān)于HBsAg仍然陽性，抗病毒治療后停藥維持持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答以及停藥不復(fù)發(fā)的這種狀態(tài)在相關(guān)指南中有明確的定義，明確這種狀態(tài)是指達(dá)到了有價(jià)值的治療終點(diǎn)，屬于部分免疫控制狀態(tài)。

4 小結(jié)

基于對(duì)血清HBV RNA的認(rèn)識(shí)，加之目前臨床治愈[1](持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答且HBsAg陰轉(zhuǎn)或伴有抗-HBs陽轉(zhuǎn)、ALT正常、肝組織學(xué)輕微或無病變)率較低，“準(zhǔn)臨床治愈”[35]概念應(yīng)運(yùn)而生，與臨床治愈不同，準(zhǔn)臨床治愈時(shí)血清HBsAg可以以低水平存在，但HBV RNA小于檢測(cè)下限。因此，一部分應(yīng)用NAs治療的CHB患者可以根據(jù)血清HBV RNA檢測(cè)結(jié)果判斷是否可安全停藥。

與以往認(rèn)知的血清中HBV RNA量較少且不易提取觀點(diǎn)不同，隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)及實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，通過實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測(cè)血清中HBV RNA已逐漸成熟。但關(guān)于血清HBV RNA，目前仍有待進(jìn)一步的深入研究，仍需要開展設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)及足夠病例數(shù)的臨床研究來對(duì)其達(dá)到更好的認(rèn)識(shí)。

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(本文編輯: 朱 晶)

ClinicalvalueofserumHBVRNA

LIURuixia,PANXiucheng,GENGJian.

(DepartmentofInfectiousDiseases,TheAffiliatedHospitalofXuzhouMedicalUniversity,Xuzhou,Jiangsu221000,China)

Although there are various indicators for evaluating the effect of anti-HBV therapy, they have low accuracy and sensitivity. New indicators are still needed to guide clinical practice. Recent studies have found that HBV RNA might be a new potential indicator for clinical detection. This article reviews the basic concepts of HBV RNA, related detection methods, and the value of HBV RNA in clinical diagnosis.

hepatitis B virus; RNA, viral; biological markers； review

R512.62

A

1001-5256(2017)11-2196-04

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.11.032

2017-04-27；

2017-07-05。

劉瑞霞(1991-)，女，主要從事乙型肝炎的免疫治療研究。

潘修成，電子信箱：xzpxc68@126.com。