瑪咖中主要酰胺類化合物的提取工藝優(yōu)化研究

邵炎，李蕓，劉濤

（1.廣東藥科大學(xué)藥用生物活性物質(zhì)研究所，廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

瑪咖中主要酰胺類化合物的提取工藝優(yōu)化研究

邵炎1，2，李蕓1，2，劉濤1，*

（1.廣東藥科大學(xué)藥用生物活性物質(zhì)研究所，廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006；2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

瑪咖酰胺類化合物是新資源食品原料瑪咖粉中的特征性成分。為了富集瑪咖中的瑪咖酰胺類單體化合物，首次采用酸堿反應(yīng)去除脂肪酸類主要干擾雜質(zhì)，并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，超聲初提瑪咖酰胺的最佳條件為：以乙醚為提取溶劑，料液比1∶30（g/mL），超聲時(shí)間30min；酸堿反應(yīng)的最佳條件為：氫氧化鈉添加量5.0mL，反應(yīng)溫度50℃和酸堿反應(yīng)時(shí)間50min。在最優(yōu)條件下，提取物中的瑪咖酰胺含量為20.79%，相對(duì)于DBS53/001-2015《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)瑪咖干制品》中的提取方法，它的相對(duì)含量上升了73.9%。

瑪咖；瑪咖酰胺；脂肪酸；酸堿反應(yīng)

瑪咖（Lepidium meyenii Walp.）為十字花科獨(dú)行菜屬，一年或兩年生草本植物，原產(chǎn)于秘魯海拔3 500m以上安第斯山區(qū)，國(guó)內(nèi)于本世紀(jì)初引進(jìn)后主要種植于云南和新疆等地，2011年瑪咖粉獲批為新資源食品原料。目前瑪咖的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)和藥學(xué)研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和整體生物功效上，針對(duì)活性組分或單一活性成分所開(kāi)展的研究較少，特別是被廣泛認(rèn)為是瑪咖生物功效的特征活性成份－瑪咖酰胺類化合物[1]，瑪咖酰胺具有廣泛的藥用價(jià)值，如改善性功能[2-3]、抑制脂肪酸水解酶活性[4-5]、保護(hù)神經(jīng)作用[6]和抗疲勞[7]等。然而，瑪咖酰胺類單體化合物在瑪咖中含量低、且分離提取效率低，限制了瑪咖酰胺藥理藥效研究和市場(chǎng)應(yīng)用，本研究旨在探究一種可以有效的富集瑪咖酰胺，進(jìn)而更有效提取瑪咖中瑪咖酰胺的新方法。

到目前為止，已公開(kāi)報(bào)道的瑪咖酰胺類單體化合物已有32種，其中間甲氧基-芐基-亞麻酰胺（圖1A），芐基-亞麻酰胺（圖1B），間甲氧基-芐基-亞油酰胺（圖1C），芐基-亞油酰胺（圖1D）和芐基-十六烷酰胺（圖1E）所占比例最大?，斂０防砘再|(zhì)表明它們屬于酰胺類生物堿，極性較小，易溶于己烷或氯仿，也可溶于甲醇等有機(jī)溶劑中[8-9]。針對(duì)這類具有特殊生物活性的酰胺類生物堿，可采取的分離提取方法包括溶劑萃取[10]、超聲波提取[11]、柱色譜分離[12-13]、薄層色譜法分析鑒定[14-15]、高效液相色譜法分離分析[16]等，但采用這些提取純化方法，大部分為分析用途，且活性成分損失比較嚴(yán)重且干擾雜質(zhì)很難去除。干擾雜質(zhì)主要包括脂肪酸及其酯類，植物甾醇和其它類的生物堿等，通過(guò)氫氧化鈉和脂肪酸等物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成不溶于有機(jī)溶劑的酯類物質(zhì)，可除去脂肪酸類干擾雜質(zhì)，提高分離提取瑪咖酰胺類化合物的效率?；诖耍狙芯繑M結(jié)合酸堿反應(yīng)優(yōu)化選擇反應(yīng)條件，去除干擾雜質(zhì)并富集活性成分，優(yōu)化瑪咖中主要酰胺類化合物的提取工藝，為瑪咖的深層次開(kāi)發(fā)和瑪咖酰胺的藥理藥效研究提供提取工藝參考。

圖1 5種主要瑪咖酰胺的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures and names of 5 main macamides

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

新鮮瑪咖：來(lái)源于云南麗江永勝縣種植基地；N－芐基－十六碳酰胺標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自中山優(yōu)諾生物科技發(fā)展有限公司；乙腈（色譜純）：美國(guó)霍尼韋爾；氫氧化鈉、乙醚、乙醇等：均為分析純?cè)噭?/p>

DHG-9053A鼓風(fēng)干燥箱、DZF-6210真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-3A數(shù)顯恒溫三溫水浴鍋：金壇市精達(dá)儀器制造廠；AL104電子天平：梅特勒托利多（上海）有限公司；5810R低溫冷凍離心機(jī)：德國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；BILON-S650CT多用途恒溫超聲波提取器：上海比朗儀器制造有限公司；配有二極管陣列紫外檢測(cè)器（2998）的液相色譜儀（2695）、UPLC/Q-TOFMS（ESI離子源）液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)沃特世公司；LG18中草藥粉碎機(jī)：黃崗永安醫(yī)療器械公司。

1.2 方法

1.2.1 制備瑪咖粉

挑選健康的瑪咖鮮果洗凈，均勻切片，鼓風(fēng)干燥箱干燥（40℃，12 h），再經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩后，用分裝袋包裝，放置于真空干燥箱中備用。

1.2.2 高效液相檢測(cè)條件

色譜柱：Waters SunFireTUC18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（B）和水（A）；梯度洗脫程序0～10min：50%B～85%B，10min～25min：8 5%B～95% B；流速：1mL/min；液相紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm。

1.2.3 瑪咖酰胺的提取工藝

準(zhǔn)確稱取1.0 g瑪咖粉（天平稱取1.0 g±0.01 g）于50mL離心管中，加入30mL乙醚后擰緊瓶蓋，置于多用途恒溫超聲波提取器中（40℃，超聲時(shí)間1.5 s，間隙時(shí)間1.0 s，變幅桿Φ6，輸出功率50%），超聲提取30min，然后4 000 r/min，離心15min。將上清液倒入100mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸干后加入5mL乙醇，充分搖勻溶解提取物后吸取至容量瓶中，加入5mL氫氧化鈉（1 mol/L）后50℃水浴加熱50 min，加2 mL碳酸（1 mol/L）中和，將溶液蒸干后加入5 mL正己烷和30 mL純水超聲溶解，萃取取正己烷層，通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行分析和計(jì)算含量。

1.2.4 瑪咖酰胺提取標(biāo)準(zhǔn)方法（DBS 53/001-2015《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)瑪咖干制品》）

樣品粉粹，過(guò)40目篩，準(zhǔn)確稱取1.0 g瑪咖粉（天平稱取1.0 g±0.01 g）于100mL玻璃三角瓶中，加入40mL石油醚后用封口膜封口，置于超聲清洗機(jī)中超聲提取15min（200W，50℃）。超聲完成后搖勻，將提取液和瑪咖渣一同倒入50mL離心管中，4 000 r/min離心10min。將上清液倒入100mL圓底燒瓶中，旋蒸干后加入4mL乙腈，充分搖勻溶解提取物后吸取至5mL容量瓶，再加0.8mL乙腈至圓底燒瓶搖勻后吸取至上述容量瓶，取適量乙腈定容至5mL。

1.2.5 水分測(cè)定

水分采用GB 5009.3-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》方法（減壓干燥法）進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 瑪咖酰胺含量（Y）計(jì)算

式中：Y為試樣中瑪咖酰胺的含量，mg/kg；C為樣液中瑪咖酰胺的濃度，μg/mL；V為試樣提取物定容的正己烷體積，mL；M為試樣質(zhì)量，g；W為試樣含水量，g/100 g。

參考云南DBS 53/001-2015《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)瑪咖干制品》中的方法，這里把瑪咖中5種主要瑪咖酰胺的總含量計(jì)算為瑪咖中瑪咖酰胺的總量。采用Excel、Origin 8.0和SPSS等軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瑪咖酰胺的鑒定

樣品一為精密配置0.05mg/mLN－芐基－十六碳酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的正己烷溶液。樣品二為按照前文1.2.3正交優(yōu)化所得最佳工藝條件，制備得到瑪咖酰胺溶液。樣品三為按照云南省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)頒布的DBS53/001-2015《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)瑪咖干制品》中的標(biāo)準(zhǔn)提取方法得到的溶液。將3組樣品溶液稀釋10倍，分別進(jìn)樣10μL后，通過(guò)高效液相色譜法分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 瑪咖酰胺的紫外色譜圖Fig.2 The typical chromatograms of macamides

分別對(duì)圖2A、圖2B色譜圖中峰1～3通過(guò)質(zhì)譜正離子模式，進(jìn)行全掃描分析，檢測(cè)出峰1包含兩種分子離子（[M+H]+，398.275 9和368.253 9）；峰2包含兩種分子離子（[M+H]+，400.299 6和370.284 2）；峰3包含一種分子離子（[M+H]+，346.295 2），分別對(duì)應(yīng)著瑪咖中5種主要瑪咖酰胺類化合物，即間甲氧基-芐基-亞麻酰胺（397.60），芐基-亞麻酰胺（367.57），間甲氧基-芐基-亞油酰胺（399.62），芐基-亞油酰胺（369.59）和芐基-十六烷酰胺（345.57），與瑪咖酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（圖2C）相比，圖2A和圖2B中峰3保留相近，所以進(jìn)一步表明本研究的提取方法可以分離出瑪咖中特征活性成分。圖2A和圖2B，在相同質(zhì)量原料條件下，經(jīng)過(guò)最佳工藝后，5種主要的瑪咖酰胺的相對(duì)含量也明顯上升。

2.2 瑪咖酰胺初提取的單因素優(yōu)化試驗(yàn)

瑪咖酰胺初提取的單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 超聲提取瑪咖酰胺的單因素試驗(yàn)Fig.3 Single factor experiments of macamides extracted with ultrasonic

2.2.1 選擇最佳的提取溶劑

稱取8份瑪咖粉樣品，每份1.0 g，按極性從大到小的順序，選擇甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、正己烷和石油醚作為瑪咖的提取溶劑，料液比為1∶30（g/mL），超聲提取30min后，離心蒸干，最后每組用正己烷定容5mL。以N－芐基－十六碳酰胺的含量為指標(biāo)，通過(guò)高效液相色譜法計(jì)算分析，考察有機(jī)溶劑對(duì)瑪咖酰胺得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3A。當(dāng)乙醚作為提取溶劑時(shí)，N－芐基－十六碳酰胺得率最高。

2.2.2 超聲提取時(shí)間的確定

選定料液比為1∶30（g/mL）、提取溶劑為乙醚，考察超聲提取時(shí)間（10、20、30、40、50、60min）對(duì)N－芐基－十六碳酰胺含量的影響，檢測(cè)其含量的步驟同上，結(jié)果見(jiàn)圖3B。N－芐基－十六碳酰胺的含量隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)先升后降，這是由于開(kāi)始隨著超聲時(shí)間的增加，瑪咖中有效成分流開(kāi)始慢慢流出；但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，提取時(shí)間對(duì)目標(biāo)化合物含量影響不大。因此，選擇30min作為最佳的超聲提取時(shí)間。

2.2.3 料液比的確定

稱取6份瑪咖粉樣品，每份1 g，按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）分別加入乙醚，檢測(cè)N－芐基－十六碳酰胺含量的步驟同上，結(jié)果見(jiàn)圖3C。從折線圖中可以看出，隨著料液比的增加，N－芐基－十六碳酰胺的含量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)料液比大于1∶30（g/mL）時(shí)，目標(biāo)化合物得率變化不大，且料液比對(duì)瑪咖酰胺得率有顯著的影響。因此，從實(shí)際操作和生產(chǎn)成本等角度考慮最佳的料液比選1∶30（g/mL）。

2.3 酸堿反應(yīng)條件的單因素試驗(yàn)

酸堿反應(yīng)條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 酸堿反應(yīng)的單因素試驗(yàn)Fig.4 Single factor experiment in acid-base reaction

2.3.1 氫氧化鈉添加量的確定

稱取1.0 g瑪咖粉，按最佳的超聲提取條件得到提取液，然后以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15min，蒸干上清液后，用30mL乙醇定容于容量瓶中。平行設(shè)定6組試驗(yàn)，每組5.0mL樣品溶液，各加入氫氧化鈉（1.0mol/L）添加量為（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL），水浴加熱溫度為40℃，進(jìn)行50min酸堿反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖4A。隨著氫氧化鈉濃度的增加，瑪咖酰胺含量顯著增加，在添加4.0mL氫氧化鈉時(shí)，瑪咖酰胺總含量最高。當(dāng)氫氧化鈉添加量大于4.0mL時(shí)，其含量有下滑的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)閴A性條件下，瑪咖酰胺穩(wěn)定性下降。綜合考慮，選擇3.0、4.0、5.0mL作為酸堿反應(yīng)正交試驗(yàn)氫氧化鈉添加量的因素水平。

2.3.2 酸堿反應(yīng)時(shí)間的確定

選定氫氧化鈉（1.0mol/L）添加量為4.0mL，水浴加熱溫度為40℃，考察酸堿反應(yīng)時(shí)間（20、30、40、50、60、70min）對(duì)瑪咖中瑪咖酰胺純度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4B?，斂０返募兌入S著時(shí)間延長(zhǎng)緩慢增加，可能因?yàn)殡S著酸堿反應(yīng)時(shí)間的增加，脂肪酸等雜質(zhì)與氫氧化鈉反應(yīng)的越充分，其純度升高，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，反應(yīng)達(dá)到平衡，其得率變化不大。且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，能耗成本增加。因此，選擇40、50、60min作為酸堿反應(yīng)正交試驗(yàn)的時(shí)間因素水平。

2.3.3 水浴加熱溫度的確定

選定水浴加熱的溫度為（30、40、50、60、70、80℃），加入4.0mL氫氧化鈉，酸堿反應(yīng)時(shí)間為50min，其他條件不變，考察溫度對(duì)瑪咖酰胺總含量的影響，結(jié)果如（圖4C）。當(dāng)溫度為40℃時(shí)，瑪咖中瑪咖酰胺的純度最高，隨著溫度的增加，其含量明顯的下降，原因可能是隨著溫度增加，瑪咖酰胺的穩(wěn)定性下降，另外，也增加的成本。綜合考慮，選擇30、40、50℃作為酸堿反應(yīng)正交試驗(yàn)的溫度因素水平。

2.4 酸堿反應(yīng)法提取瑪咖酰胺正交試驗(yàn)優(yōu)化

2.4.1 酸堿反應(yīng)工藝正交試驗(yàn)

為了進(jìn)一步優(yōu)化酸堿反應(yīng)條件，純化瑪咖酰胺類單體化合物，以氫氧化鈉添加量、水浴加熱溫度和酸堿反應(yīng)時(shí)間為因素，每個(gè)因素設(shè)立3個(gè)水平，以瑪咖酰胺的含量為衡量指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），分析酸堿反應(yīng)各因素對(duì)瑪咖酰胺含量的影響。正交試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見(jiàn)表2和表3。

從表2可以看出，在酸堿反應(yīng)的3個(gè)影響因素中，影響程度大小依次為A>C>B，即氫氧化鈉添加量對(duì)瑪咖中瑪咖酰胺的總含量影響最大，溫度的影響最小。最佳酸堿反應(yīng)工藝參數(shù)組合為A3B3C2，即氫氧化鈉添加量5.0mL、溫度50℃、時(shí)間50min。在最佳酸堿反應(yīng)條件下，咖咖中瑪咖酰胺純度為20.53%。

表1 酸堿反應(yīng)中正交試驗(yàn)因素水平Table1 The orthogonal experiment factor levels in acid-base reaction

表2 酸堿反應(yīng)中正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 Orthogonal experiment results of acid-base reaction

表3 酸堿反應(yīng)的方差分析Table3 Variance analysis results of acid-base reaction

由表3可知，在影響瑪咖中瑪咖酰胺純度的3個(gè)因素中，氫氧化鈉添加量對(duì)瑪咖酰胺純度的影響最為顯著，溫度的影響最小。

2.4.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照正交試驗(yàn)分析所得的最佳工藝參數(shù)組合，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以瑪咖酰胺提取的工藝步驟，3次重復(fù)測(cè)定瑪咖中瑪咖酰胺總含量分別為20.95%、20.75%和20.66%，平均值為20.79%，略高于正交試驗(yàn)的最高得率（20.53%）從而驗(yàn)證了正交試驗(yàn)的結(jié)論。經(jīng)計(jì)算，圖2A和圖2B中瑪咖酰胺總含量分別為13.35%和23.21%，相對(duì)于DBS 53/001-2015《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)瑪咖干制品》中的提取方法，本方法所提取的樣品中瑪咖酰胺的相對(duì)含量上升了73.86%，其中峰1、峰2、峰3所對(duì)應(yīng)的瑪咖酰胺單體化合物的含量分別增加203.92%、171.81%和167.05%。通過(guò)酸堿反應(yīng)過(guò)后，所得到產(chǎn)物的脂肪酸等雜質(zhì)含量減少，產(chǎn)品的純度高，瑪咖酰胺類化合物得率提高。

3 研究結(jié)論與展望

在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化，確定了酸堿反應(yīng)提取瑪咖酰胺類化合物的優(yōu)化工藝參數(shù)，即料液比為1∶30（g/mL），最佳的提取溶劑為乙醚，超聲提取時(shí)間為30min，氫氧化鈉（1mol/L）添加量為5.0mL，溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為50min。在最佳的試驗(yàn)條件下，瑪咖酰胺的含量為20.79%，相對(duì)于DBS53/001-2015《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)瑪咖干制品》中的提取方法，其含量上升了73.9%。結(jié)果表明，酸堿反應(yīng)可以有效除去脂肪酸等干擾雜質(zhì)，有效富集瑪咖酰胺類化合物，后繼也可通過(guò)液相色譜等方法進(jìn)一步獲得瑪咖酰胺類單體化合物。

近年來(lái)我國(guó)瑪咖種植和加工產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，但同時(shí)也伴隨著產(chǎn)業(yè)盲目擴(kuò)張，藥用價(jià)值導(dǎo)向混亂，市場(chǎng)亂象頻出的困局。瑪咖酰胺這類具有特殊生物功效和潛在市場(chǎng)價(jià)值的化合物，除了將其作為瑪咖質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)外，通過(guò)優(yōu)化改進(jìn)現(xiàn)有分離技術(shù)，實(shí)現(xiàn)瑪咖酰胺的有效富集和純化，有望為瑪咖的深度開(kāi)發(fā)和藥理藥效研究提供更好的樣品來(lái)源，促進(jìn)瑪咖產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步健康發(fā)展和藥用價(jià)值開(kāi)發(fā)。

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Study on Optimization of Extraction Process of the Main Macamides from Maca（Lepidium meyenii Walp.）

SHAO Yan1，2，LI Yun1，2，LIU Tao1，*
（1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances，Institute of Pharmaceutical Bioactive Substances Research，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，Guangdong，China；2.School of Chinese Traditional Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Macamides was the active marker compounds of maca powders.Macamides was gathered from maca powders through acid-base reaction firstly，which could remove the main impurities such as fatty acid and so on. Then extraction process was optimized.The preliminary results presented that the optimum conditions of supersonic extraction of macamides as follows：the best extraction solvent was diethyl ether，ratio of material to solvent was 1∶30（g/mL）and time of extraction was 30 min；the optimal acid-base reaction conditions was that reaction temperature of 50℃，the volume of so dium hydroxide of 5.0mL and reaction time of 50 min.Under optimized conditions，the content of the macamides in maca extract could reach to 20.79%，compared with the extraction method in THE MACA DRY PRODUCTS QUALITY STANDARD（DBS 53/001-2015），it increased by 73.9%.

maca；macamides；fatty acid；acid-base reaction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.009

2016-05-13

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（21206020）；廣東省公益研究與能力建設(shè)專項(xiàng)資金（2014A010107027）

邵炎（1990—），男（漢），碩士研究生，研究方向：中藥活性成份研究與開(kāi)發(fā)。

*通信作者：劉濤（1981—），男，副研究員，博士。