動物源性產(chǎn)品中鹽酸克倫特羅檢測方法的研究進(jìn)展

張瑞華，李芳，康懷彬，2，*，鄒良亮，蔡超奇

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471023；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450000）

動物源性產(chǎn)品中鹽酸克倫特羅檢測方法的研究進(jìn)展

張瑞華1，李芳1，康懷彬1，2，*，鄒良亮1，蔡超奇1

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽471023；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450000）

對鹽酸克倫特羅檢測方法進(jìn)行了概述，比較了色譜法、免疫法與生物傳感器分析法的區(qū)別，并討論了最新檢測方法的進(jìn)展與方向，為今后在鹽酸克倫特羅殘留檢測方法上提供新思路。

鹽酸克倫特羅；檢測方法；進(jìn)展；新思路

鹽酸克倫特羅（clenbuteerol hydrochloride，CLB），是一種腎上腺類神經(jīng)興奮劑，因其能促進(jìn)脂肪分解、蛋白合成，又被稱為“瘦肉精”。CLB結(jié)構(gòu)中有多個可修飾位點(diǎn)，通過結(jié)合不同基團(tuán)可以形成一系列類似物[1]。CLB極易被機(jī)體吸收，在動物組織中蓄積殘留，且CLB性質(zhì)穩(wěn)定，一般的烹飪方法不能使其分解[2]。由此引發(fā)的中毒事件也不斷發(fā)生，各國都采取了相應(yīng)的法律法規(guī)監(jiān)控在肉中的殘留量。中國農(nóng)業(yè)部的第235號公告修訂了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定CLB在所有動物性食品中不得檢出[3]。因此，加強(qiáng)CLB殘留監(jiān)督監(jiān)測十分必要。

由于CLB半衰期長，易蓄積在動物體內(nèi)，其中大部分隨尿液排出，少數(shù)殘留在動物肝臟、腎臟、肌肉等部位[4]。目前文獻(xiàn)[5-6]報道中常用固相萃取法處理肉樣品，固相萃取技術(shù)具有操作簡便、成本低、環(huán)保和可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于樣品分離和濃縮過程中。此外，湯凱潔等[7]用分子印跡聚合物（MIPs）富集豬肝中的CLB用于高效液相色譜檢測。王宛等[8]采用接枝中空纖維膜過濾去除樣品中磷脂和蛋白質(zhì)，用于液質(zhì)聯(lián)用的檢測。由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，要想達(dá)到較低的檢測限要對樣品作一系列的處理，這就相應(yīng)的增加了成本。本文結(jié)合樣品的處理方法對國內(nèi)外檢測方法進(jìn)行了分析闡述，為CLB快速檢測的研究提供參考。

1 色譜法

1.1 高效液相色譜法（HPLC）

HPLC檢測方法多集中在類（多）殘留檢測以及和其他檢測技術(shù)聯(lián)用方面[9]。國標(biāo)（GB/T5009.192-2003《動物性食品中克倫特羅殘留量的測定》）中HPLC被作為半確證法。HPLC不僅要對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，樣品的前處理方法也很關(guān)鍵。國標(biāo)中樣品前處理方法復(fù)雜，研究人員在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，并未獲取理想的效果。2015年朱曉艾等[10]分析比較了4種樣品前處理的方法，并對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到的線性范圍為0.025μg/mL～0.400μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6，回收率達(dá)88.55%～94.03%。研究發(fā)現(xiàn)對肉樣的前處理只需液液提取、蛋白質(zhì)沉淀兩個過程，快速簡單，且出峰時間短。因此適用于樣品數(shù)量較多時復(fù)檢，以快速檢測出陽性或疑似陽性的樣品。

1.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）

GC-MS是目前較成熟的一種聯(lián)用技術(shù)，它把色譜的高效快速分離和質(zhì)譜高靈敏的定性分析結(jié)合起來，因此具有分離效果好、靈敏度高、既可定性又可以定量等優(yōu)點(diǎn)。由于GC適用于有較低沸點(diǎn)和較高熱穩(wěn)定性的樣品，而CLB的極性大沸點(diǎn)高，故測定前要對CLB衍生化。YiWen等[11]用GC-MS檢測分析CLB殘留之前，采用固相萃取/聚合物整體微萃取技術(shù)對豬肉樣品進(jìn)行處理，檢出限為0.13μg/kg。GC-MS可以準(zhǔn)確地對某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析，但是衍生化處理會造成實(shí)驗(yàn)偏差。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）

在檢測復(fù)雜樣品時，液相與質(zhì)譜聯(lián)用在一定程度上排除基質(zhì)干擾，克服離子抑制現(xiàn)象，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)已成為迅速的分析方法之一。而HPLC-MS-MS聯(lián)用時信噪比可進(jìn)一步提高。陳海玲等[12]建立了HPLC-MS同時測定豬尿中CLB和萊克多巴胺的方法，采用MCX固相萃取柱萃取凈化，并對質(zhì)譜條件各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到豬尿中克倫特羅和萊克多巴胺的檢出限均為1.0μg/kg。此方法適合生豬宰殺前快速、有效監(jiān)測。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法能對CLB進(jìn)行定性、定量測定，靈敏度較高，但此類方法需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理（如采用氣相色譜測定時，需要進(jìn)行甲酯化衍生化反應(yīng)），操作復(fù)雜，測試時間長、費(fèi)用高，并且儀器昂貴、移動性差，難以推廣普及。

2 免疫分析法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附分析法

酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）基本原理是競爭性抗原抗體特異性反應(yīng)。研究人員可根據(jù)抗體產(chǎn)生機(jī)理設(shè)計合成針對一類藥物的單克隆或多克隆抗體，實(shí)現(xiàn)對同一類藥物的高通量檢測。目前已廣泛應(yīng)用于臨床和食品安全檢測。因CLB在國外應(yīng)用較早，其ELISA檢測方法的研究也比國內(nèi)早[13]。目前，歐盟、美國在CLB的宰前尿檢、血檢及屠宰現(xiàn)場檢疫時都將其列為主要的篩選法。許春光等[14]用Randox公司產(chǎn)的ELISA檢測試劑盒，結(jié)合ELX800通用酶標(biāo)儀對442份生豬尿樣進(jìn)行檢測，與GC-MS檢測結(jié)果一致。但無法滿足CLB殘留痕量、超痕量檢測的要求，所以ELISA一直作為大樣本篩選的方法。

2.2 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法

1994年Rongen等[15]將化學(xué)發(fā)光標(biāo)記應(yīng)用于免疫分析，發(fā)現(xiàn)它的檢測范圍廣、發(fā)光反應(yīng)快、孵育時間短、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，可適用于各種類型的免疫分析?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析是化學(xué)發(fā)光法和酶免疫法結(jié)合的產(chǎn)物，同時具有高靈敏性和高特異性，近年來得到廣泛應(yīng)用。常用的酶是辣根過氧化物酶（HRP），而魯米諾及其衍生物是最常用的酶促反應(yīng)發(fā)光劑。用化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測不同樣品中CLB殘留的相關(guān)文獻(xiàn)報道如表1所示，對尿液采用間接夾心競爭免疫反應(yīng)，對豬肉采用直接競爭免疫法，結(jié)果都能達(dá)到較低的檢測限，且檢測限差異不明顯。

表1 不同類型的化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測CLBTable1 Different types chemiluminescence enzyme immunoassay the detection of CLB

CLEIA與ELISA不同之處在于酶標(biāo)記反應(yīng)體系是化學(xué)發(fā)光反應(yīng)?；瘜W(xué)發(fā)光的優(yōu)點(diǎn)是線性范圍寬、靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動化程度高、檢測速度快、不受樣本數(shù)量影響、試劑質(zhì)量穩(wěn)定。由于發(fā)光在瞬間完成，峰值出現(xiàn)的時間短，而且光背景高、成本相對較高。因此該法的應(yīng)用受到一定的限制。

2.3 膠體金免疫技術(shù)

在堿性環(huán)境中，帶負(fù)電荷的膠體金與帶正電荷蛋白質(zhì)分子基團(tuán)通過吸附作用而形成牢固的結(jié)合，標(biāo)記蛋白的生物活性并未受到影響。膠體金具有合成快速簡單、大小均一、表面容易被硫基及其它生物基團(tuán)修飾且生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，近年來膠體金檢測技術(shù)被廣泛應(yīng)用在食品安全監(jiān)測中。2006年，G.P.Zhang等[19]用金標(biāo)單克隆抗體制成層析式試紙條檢測殘留在尿液中CLB，檢測限能達(dá)到1.0μg/mL，用特殊的模條掃描儀測定檢測限可達(dá)0.1μg/mL。傳統(tǒng)的膠體金免疫層析方法主要是通過肉眼觀察檢測線的有無來判斷檢測結(jié)果，對待測物進(jìn)行定性或者半定量檢測，檢測結(jié)果易受溫度、光線等環(huán)境因素和檢測者的主觀因素影響?；谀z體金光學(xué)讀取儀的膠體金免疫層析快速定量檢測方法具有速度快、操作簡便、靈敏度高、可定量檢測、數(shù)據(jù)可存儲、適合現(xiàn)場快速篩查等優(yōu)點(diǎn)[20]。

2.4 放射性免疫技術(shù)（RIA）

RIA是一種新型檢測技術(shù)，它是對微生物受體進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)合化學(xué)發(fā)光技術(shù)、生物發(fā)光技術(shù)和ELISA來進(jìn)行檢測的[21]。RIA檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)。目前國外已經(jīng)開發(fā)出應(yīng)用該技術(shù)的試劑盒，此外還建立了用受體代替抗體結(jié)合CLB的分析法，此方法檢測限可達(dá)到2.4 ng/g[22]。但該方法所用的儀器昂貴，對試驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，且放射性同位素對工作人員有一定的傷害，不屬于目前主要的分析方法。

3 生物傳感器分析技術(shù)

生物傳感分析技術(shù)是生物反應(yīng)技術(shù)和傳感技術(shù)有機(jī)結(jié)合的產(chǎn)物，該技術(shù)是當(dāng)今世界上備受關(guān)注的綜合高科技技術(shù)之一。其原理是用生物活性物質(zhì)（如酶、抗體、抗原、細(xì)胞等）作為敏感基元，能對被測物進(jìn)行高選擇性地識別，配以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)換器，達(dá)到檢測的目的。生物傳感器因具有選擇性好、響應(yīng)速度快、樣品用量少、操作簡易、結(jié)構(gòu)簡單、體積小等優(yōu)點(diǎn)。近年來成為科研工作者研究的熱點(diǎn)。早在上世紀(jì)七十年代國外就有報道用免疫生物傳感技術(shù)檢測CLB[23]，國內(nèi)生物傳感器用于CLB檢測起步較晚，目前還是處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。

2003年TRAYNORIM等[24]報道使用生物傳感檢測牛肝中多種β-興奮劑。其中的CLB的檢測限為0.11 ng/mL?；厥章蚀笥?5%。2014年廉雙秋[25]等將CLB-BSA作為傳感芯片特異識別探針結(jié)合到生物芯片表面，通過溶液競爭法結(jié)合表面等離子體共振技術(shù)（SPR）檢測CLB，檢測限為1.03 ng/mL。

目前最有發(fā)展前景的是酶免疫傳感技術(shù)分析法，酶免疫傳感技術(shù)充分利用酶的化學(xué)放大作用，而且可以縮短檢測時間。比傳統(tǒng)的ELISA更靈敏、更簡便。肖飛[26]等構(gòu)建了雙重信號放大的競爭型免疫傳感器，構(gòu)建的免疫傳感器在0.01 ng/mL～100 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢測限達(dá)4.5 pg/mL。

4 其他分析方法

表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）標(biāo)記方法結(jié)合了現(xiàn)代生物標(biāo)記方法與SERS光譜方法。作為一種新穎的標(biāo)記技術(shù)，它利用金或銀等金屬納米粒子來增強(qiáng)拉曼信號，并將其作為標(biāo)記示蹤信號。基于SERS免疫標(biāo)記原理，朱桂池[27]等研發(fā)出一種新的CLB檢測方法，其主要原理如圖1所示。

圖1 SERS標(biāo)記方法應(yīng)用于CLB的檢測原理圖[27]Fig.1 Overview of SERS labeled method application in celenbuterol detection

首先使樣品中游離的CLB和固定在固相基底表面的CLB完全抗原競爭性地與CLB抗體反應(yīng)，其中CLB抗體和標(biāo)記分子共同與金膠偶聯(lián)。通過檢測標(biāo)記分子SERS信號強(qiáng)度的變化，達(dá)到檢測CLB的目的。檢測范圍為0.1 pg/mL至100 pg/mL，其檢測靈敏度最低可達(dá)0.1 ppt（pg/mL），比ELISA的檢測限降低了至少兩個數(shù)量級。

2016年，龔雨含等[28]采用光聲光譜法進(jìn)行測量，利用加權(quán)修正的方法建立了CLB光聲光譜實(shí)時在線測量模型，分析了豬肉中水對其測量的干擾機(jī)制，為CLB測量儀的設(shè)計提供理論基礎(chǔ)。設(shè)計了豬肉中CLB光聲光譜檢測試驗(yàn)系統(tǒng)，并驗(yàn)證了該方法可行性及快速性。

5 結(jié)論

本文綜述了目前國內(nèi)外檢測鹽酸克倫特羅的方法，發(fā)現(xiàn)利用自動化設(shè)備與儀器聯(lián)接對樣品進(jìn)行前處理從而實(shí)現(xiàn)高效化、智能化是今后儀器檢測的發(fā)展趨勢。為了控制鹽酸克倫特羅的殘留，嚴(yán)格執(zhí)法是基礎(chǔ)，而有效的檢測方法是技術(shù)保障。因此，研究開發(fā)更快速、高效、成本低的現(xiàn)場定性定量檢測方法是未來檢測鹽酸克倫特的發(fā)展方向。

[1]徐曉嬰.化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測鹽酸克倫特羅殘留[D].上海:上海交通大學(xué),2009

[2]王海花,黃素珍.鹽酸克倫特羅的危害性與檢測[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2003,24(4):41-43

[3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第235號公告—動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].2002

[4]PREZELJ A,OBREZA A,PECAR S.Abuse of clenbuterol and its detection[J].Current Medicinal Chemistry,2003,10(4):281-90

[5]孟文瑛,郭志謀,沈偉健,等.一種新型固相萃取柱結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法選擇性富集測定豬肉中的鹽酸克倫特羅[J].色譜,2012,30(2):141-145

[6]哈婧,王秋平,張佳麗.固相萃取-流動注射化學(xué)發(fā)光法測定豬肉中鹽酸克倫特羅[J].食品科學(xué),2012(20):167-170

[7]湯凱潔,羅秋水,余瑞龍,等.分子印跡固相萃取/高效液相色譜法測定豬肝中鹽酸克倫特羅的方法研究[J].分析測試學(xué)報,2016, 35(1):115-118

[8]王宛,覃素姿,李林森,等.接枝中空纖維膜過濾-液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法檢測血漿中鹽酸克倫特羅[J].分析試驗(yàn)室,2015,34(3): 263-266

[9]湯軼偉,王碩,勵建榮,等.β-興奮劑鹽酸克倫特羅殘留檢測方法最新研究進(jìn)展[J].中國食品學(xué)報,2013,13(5):154-160

[10]朱曉艾,陳雅君,陳雪香,等.高效液相色譜法檢測豬肉中鹽酸克倫特羅的前處理方法[J].食品與機(jī)械,2015(2):106-109

[11]WEN Y,WANG Y,FENGY Q.Extraction of clenbuterol from urine using hydroxylated poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate)monolith microextraction followed by high-performance liquid chromatography determination[J].Journal of Separation Science,2007,30(17):2874-2880

[12]陳海玲,郝春莉,黃華斌,等.高效液相色譜-質(zhì)譜法同時測定豬尿中克倫特羅和萊克多巴胺[J].理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊),2011(7):859-862

[13]BACIGALUPOM A,LUS A,MERONI G,et al.Comparison of timeresolved fluoroimmunoassay and immunoenzymometric assay for clenbuterol[J].Analyst,1995,120(8):2269-2271

[14]許春光,楊克軍.酶聯(lián)免疫技術(shù)在生豬鹽酸克倫特羅檢測中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代儀器,2005,11(6):46-47

[15]RONGEN H A H,HOETELMANS RMW,BULTA,et al.Chemiluminescence and Immunoassays[J].Journal of Pharmaceutical＆ Biomedical Analysis,1994,12(4):433-462

[16]RODA A,MANETTA A C,PIAZZA F,et al.A rapid and sensitive 384-microtiter wells format chemiluminescent enzyme immunoassay for clenbuterol[J].Talanta,2000,52(2):311-318

[17]胥傳來,彭池方,郝凱,等.化學(xué)發(fā)光酶免疫方法檢測克倫特羅殘留[J].分析化學(xué),2005,33(5):699-702

[18]王碩,李細(xì)芬,生威,等.增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光酶免疫法對豬肉中鹽酸克倫特羅的檢測[J].分析測試學(xué)報,2010,29(3):215-219

[19]ZHANG G P,WANGX N,YANG JF,et al.Development of an immunochromatographic lateral flow test strip for detection of β-adrenergic agonist Clenbuterol residues[J].Journal of Immunological Methods,2006,312(1/2):27-33

[20]彭濤.膠體金免疫層析法快速定量檢測豬尿中β2-受體激動劑殘留的研究[D].南昌:南昌大學(xué),2015

[21]米建萍.鹽酸克倫特羅檢測方法的研究進(jìn)展[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(8):1687-1689

[22]裴艷濤,孫繼國,林密,等.動物性產(chǎn)品中“瘦肉精”殘留的檢測方法研究進(jìn)展[J].動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué),2004,21(1):24-29

[23]KOPITAR Z,ZIMMER A.Comparison of the pharmacokinetic profiles of clenbuterol in rat and dog during toxicological studies(author's transl)[J].Arzneimittel-Forschung,1976,26(7a):1450-1455

[24]TRAYNORI M,CROOKSSR H,BOWERS J,et al.Detection of multi-β-agonist residues in liver matrix by use of a surface plasma resonance biosensor[J].Analytica Chimica Acta,2003,483(1/2): 187-191

[25]廉雙秋,崔大付,鄧紹立.利用表面等離子體共振技術(shù)檢測豬尿中鹽酸克倫特羅[J].肉類研究,2014(11):38-41

[26]肖飛,白靜,張苧丹,等.雙重信號放大的競爭型免疫傳感器的制備及其應(yīng)用于瘦肉精檢測的研究[J].化學(xué)學(xué)報,2012,70(10): 1153-1158

[27]朱桂池,胡勇軍,鐘亮,等.表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)免疫標(biāo)記方法應(yīng)用于克倫特羅的檢測[C]//中國光學(xué)學(xué)會2010年光學(xué)大會論文集,2010:9

[28]龔雨含,王崇皓,馬亮,等.基于光聲光譜法檢測鹽酸克倫特羅的研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2016(5):1267-1270

Research Progress of Clenbuterol Hydrochloride Detection Method in Animal Products

ZHANG Rui-hua1，LI Fang1，KANG Huai-bin1，2，*，ZOU Liang-liang1，CAI Chao-qi1
（1.College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，Henan，China；2.Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety，Henan Province，Zhengzhou 450000，Henan，China）

Clenbuterol hydrochloride detection methods were summarized.This paper compared the difference among chromatography，biosensor，immunoassay analysis and discussed the progress and direction of the detection method.It provided new ideas for the future on clenbuterol hydrochloride residue detection method.

clenbuterol hydrochloride；detection methods；progress；new ideas

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.047

2016-09-24

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31501563）；洛陽市畜牧局項(xiàng)目（2518）

張瑞華（1989—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與工程。

*通信作者