多指標評價核桃蛋白及多肽的抗氧化活性

李麗，阮金蘭，錢偉亮，周涵黎，王亞云，吳娜，劉陽，*

（1.武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，生物多肽糖尿病藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430223；2.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢430073）

多指標評價核桃蛋白及多肽的抗氧化活性

李麗1，2，阮金蘭1，2，錢偉亮1，周涵黎1，2，王亞云1，2，吳娜1，2，劉陽1，2，*

（1.武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，生物多肽糖尿病藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省生物多肽糖尿病藥物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢430223；2.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北武漢430073）

多指標評價藥食兩用核桃蛋白及多肽的抗氧化活性。利用DPPH·﹑O2-·﹑總還原能力和·OH 4種常用體外抗氧化活性模型，以谷胱甘肽（GSH）為對照，測定核桃蛋白及多肽抗氧化活性。在實驗范圍內(nèi)，核桃蛋白及多肽的抗氧化活性與濃度呈量效關(guān)系，且核桃多肽對DPPH·和O2-·清除能力顯著，抗氧化活性達到GSH的80%以上，對·OH清除能力亦達到GSH的50%以上。核桃蛋白及多肽均具有一定的抗氧化能力，且核桃多肽的抗氧化活性較蛋白更為顯著。

核桃蛋白；核桃多肽；抗氧化活性；谷胱甘肽

多肽是由20種天然氨基酸以不同組成和排列方式通過肽鍵互相連接形成的分子量低于10 ku化合物的總稱，已有研究表明某些動植物來源的多肽具有一定抗氧化活性，它具有安全、高效、易于消化吸收等獨特優(yōu)勢[1]，是目前國內(nèi)外藥品、保健食品和化妝品領(lǐng)域的研究熱點。核桃為四大干果之一，是藥食兩用果實，富含蛋白質(zhì)﹑脂肪﹑碳水化合物及微量元素[2]，具有健腦益智﹑延緩衰老﹑防治心腦血管疾病﹑抑菌殺蟲﹑抗氧化防癌等功效[3]。

本文在復(fù)合酶水解核桃蛋白制備核桃多肽的基礎(chǔ)上，從二苯代苦味肼基自由基（DPPH·）﹑O2-·清除率﹑總還原能力和·OH清除率4個方面對核桃多肽與核桃蛋白的體外抗氧化能力進行比較研究，評價核桃多肽及蛋白的抗氧化活性，旨在為核桃資源的深度利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

核桃蛋白及多肽均為武昌理工學(xué)院生物多肽糖尿病藥物湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心自制（核桃蛋白批號：20141204；核桃多肽批號：20141218）；DPPH（批號：M07334，BR）：成都西亞化工股份有限公司；還原性谷胱甘肽（GSH，批號：SN1108BA13，BR）：上海源葉生物科技有限公司；乙醇﹑鹽酸﹑磷酸二氫鈉﹑磷酸氫二鈉﹑FeSO4﹑鐵氰化鉀﹑三氯乙酸﹑H2O2﹑鄰二氮菲﹑鄰苯三酚﹑三氯化鐵﹑Tris：均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水為純化水。

1.2 儀器

pHs-3c雷磁pH計：上海儀電科學(xué)儀器有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計：日本島津；UPT-II-10T優(yōu)普系列超純水器：成都超純科技有限公司；CPA225D電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 DPPH·清除率測定

DPPH·在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，在紫外517 nm處有強吸收，加入有機清除劑后，孤對電子被配對[4]，紫外吸收減弱，因此，可通過測定紫外吸收的減弱程度來評價抗氧化劑清除能力的活性。

分別配制1.00﹑2.00﹑3.00﹑4.00﹑5.00mg/mL的GSH﹑核桃蛋白及多肽水溶液作為樣品溶液，取2.0mL上述溶液，加入2.0mL 0.2mmol/LDPPH溶液（95%乙醇配制），室溫放置30min，以95%乙醇調(diào)零，紫外-可見分光光度計測定其在517 nm處吸光度（A2）；同法測定2.0mL樣品溶液與2.0mL 95%乙醇混合液在517 nm處吸光度（A1）以及2.0mLDPPH溶液（0.2mmol/L）與2.0mL 95%乙醇混合液在517 nm處的吸光值（A0）[5]。按公式（1）計算DPPH·清除率。

式中：A0為空白組的吸光度值；A1為樣品組的吸光度值；A2為對照組的吸光度值。

采用鄰苯三酚法，分別配制2.00﹑3.00﹑4.00﹑5.00﹑6.00mg/mL的GSH﹑核桃蛋白及多肽水溶液作為樣品溶液。取6mL 0.05mol/LTris-HCl緩沖液（pH 8.2），分別加入上述溶液0.5mL，37℃水浴10min，加入經(jīng)37℃預(yù)熱的7mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液1mL，混勻，37℃反應(yīng)4min，用0.5mL濃鹽酸終止反應(yīng)[7]。在325 nm處分別測定其吸光度值A(chǔ)1，以等體積pH 8.2 Tris-HCl緩沖液作為空白，測定其吸光度值A(chǔ)0[7]。按公式（2）計算超氧陰離子自由基清除率。

式中：A0為空白組的吸光度值；A1為樣品組的吸光度值。

2.3 總還原能力測定

抗氧化成分將鐵氰化鉀中的Fe3+還原成Fe2+，進一步生成的普魯士藍在紫外700 nm處有最大吸收[8]，因此測定700 nm處紫外吸光值的大小可以間接反映樣品還原能力的大小，一般情況下，樣品的還原能力與抗氧化能力呈正相關(guān)[9]。

分別配制2.00﹑4.00﹑6.00﹑8.00﹑10.00 mg/mL的GSH﹑核桃蛋白及多肽水溶液，從中取1.0mL，加入1%鐵氰化鉀溶液2.5mL和2.5mL 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），混合均勻，置于50℃水浴中反應(yīng)30min，迅速冷卻，加10%三氯乙酸2.5mL，4 000 r/min離心10min。取上清液2.5mL，加蒸餾水2.5mL和0.1%三氯化鐵溶液2.5mL，混勻后靜置10min，分別測定樣品在700 nm處的吸光值[8]。

2.4 ·OH清除率測定

H2O2在Fe2+催化下分解成·OH，鄰二氮菲-Fe2+被·OH氧化成鄰二氮菲-Fe3+，于是鄰二氮菲-Fe2+絡(luò)合物在紫外510 nm處最大吸收峰消失，當(dāng)向反應(yīng)體系中加入抗氧化成分后，·OH將被全部或部分清除，鄰二氮菲-Fe2+絡(luò)合物的損傷將會減少[10]。據(jù)此，可建立樣品抗氧化活性與鄰二氮菲-Fe2+絡(luò)合物在510 nm處吸光度的關(guān)系。

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法，分別配制2.00﹑4.00﹑6.00﹑8.00﹑10.00mg/mL的GSH﹑核桃蛋白及多肽水溶液作為樣品溶液。量取1.5mL 5mmol/L鄰二氮菲溶液，依次加入0.5mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）4.0mL﹑7mmol/LFeSO4溶液1.0mL﹑樣品溶液1.0mL和0.1% H2O21.0 mL，加純水補充體積至10.0 mL，37℃水浴90min，測定510nm吸光度[11]。以純水代替H2O2溶液作為空白對照，同法處理。按公式（3）計算羥自由基（·OH）清除率。

式中：A樣品為加入樣品（抗氧化劑）及H2O2的吸光度值；A空白以純水代替樣品及H2O2的吸光度值；A未損為樣品及H2O2均用純水代替的吸光度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 核桃蛋白及多肽對DPPH·清除能力

核桃蛋白及多肽對DPPH·清除率結(jié)果見圖1。

圖1 核桃蛋白及多肽對DPPH·清除率Fig.1 The DPPH radical scavenging capacity of walnut protein and polypeptide

由圖1可知，核桃蛋白、核桃多肽和GSH對DPPH·清除率在一定范圍內(nèi)皆隨濃度增加而升高，并存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)濃度為1.00mg/mL時，核桃多肽對DPPH·清除率是核桃蛋白的4倍，隨著濃度的增加，其優(yōu)勢逐漸減弱；當(dāng)濃度達到5.00mg/mL時，兩者DPPH·清除率差異不大，接近75.00%，達到GSH的80%，可見核桃蛋白及多肽對DPPH·均較強的清除能力。

3.2 核桃蛋白及多肽對O2-·清除能力

核桃蛋白及多肽對O2-·清除率結(jié)果見圖2。

圖2 核桃蛋白及多肽對O2-·清除率Fig.2 The superoxide anion radical scavenging capacity of walnut protein and polypeptide

3.3 核桃蛋白及多肽的總還原能力

核桃蛋白及多肽的總還原能力結(jié)果見圖3。

圖3 核桃蛋白及多肽總還原能力Fig.3 The deoxidization capacity of walnut protein and polypeptide

由圖3可知，核桃蛋白﹑核桃多肽總還原能力明顯低于對照品GSH，但相同濃度的核桃多肽總還原能力幾乎是核桃蛋白的2倍。

3.4 核桃蛋白及多肽對·OH清除能力

核桃蛋白及多肽對·OH清除率結(jié)果見圖4。

圖4 核桃蛋白及多肽對·OH清除率Fig.4 The hydroxyl radical scavenging capacity of walnut protein and polypeptide

由圖4可知，在一定范圍內(nèi)三者對·OH清除能力存在一定劑量效應(yīng)。濃度相同時，三者對·OH清除能力的順序為：GSH>核桃多肽>核桃蛋白。當(dāng)濃度為2.00mg/mL時，核桃多肽對·OH清除率約為核桃蛋白的6倍；當(dāng)濃度為10.00mg/mL時，核桃多肽對·OH清除率約為核桃蛋白的4倍。因此，在2.00mg/mL～ 10.00mg/mL范圍內(nèi)，核桃多肽對·OH清除率明顯優(yōu)于核桃蛋白，且達到對照品GSH的50%以上。

4 結(jié)論與討論

GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸構(gòu)成的含巰基三肽，可與烷自由基、過氧自由基、半醌自由基等作用，是體內(nèi)非常重要的自由基清除劑[12]。據(jù)文獻報道，人體內(nèi)存在大量的自由基，雖然體內(nèi)同時存在抗氧化劑和抗氧化酶，但當(dāng)機體代謝異常時，就會打破自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，導(dǎo)致氧化應(yīng)激[13]。心臟病、糖尿病[14]、動脈粥樣硬化等疾病的產(chǎn)生與體內(nèi)自由基含量的增加有關(guān)[15]。例如，過量的自由基破壞線粒體結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細胞凋亡，減少胰島素合成與分泌，誘發(fā)糖尿病[14]；動脈粥樣硬化是由炎性氧化應(yīng)激和氧化酶活性增高導(dǎo)致[16]；而衰老也是自由基對細胞成分的有害攻擊[17]。因此，考察核桃蛋白及多肽的抗氧化活性對于核桃的深度研究具有重要意義。

本試驗以GSH作對照，利用4種體外抗氧化模型考察核桃蛋白和多肽抗氧化活性。結(jié)果表明，核桃蛋白、核桃多肽皆具有一定的抗氧化活性，且核桃多肽的活性顯著高于核桃蛋白。就DPPH·清除能力和O2-·清除能力而言，核桃多肽的效果達到對照品GSH的80%以上，對·OH清除率亦達到GSH的50%以上。綜上，核桃多肽具有明顯的抗氧化活性，有望通過后期深入研究為其綜合開發(fā)利用提供參考。

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Studies on the Antioxidant Activity of Walnut Protein and Polypeptide by Multi-index

LI Li1，2，RUAN Jin-lan1，2，QIAN Wei-liang1，ZHOU Han-li1，2，WANG Ya-yun1，2，WU Na1，2，LIU Yang1，2，*

（1.Engineering Technology Research Center of Biological Peptide Antidiabetics of Hubei Province，Synergy Innovation Center of Biological Peptide Antidiabetics of Hubei Province，School of Life Science，Wuchang University of Technology，Wuhan 430223，Hubei，China；2.School of Chemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430073，Hubei，China）

To evaluate the antioxidant activity of walnut protein and polypeptide.Compared with GSH，the antioxidant activity of walnut protein and polypeptide was measured by using the DPPH radical scavenging capacity，superoxide anion radical scavenging capacity，deoxidization capacity，and hydroxyl radical scavenging capacity.Within the experimental concentration，the antioxidant activity of walnut protein and polypeptide showed a dose-dependent manner.Moreover，the walnut polypeptide significantly exhibited DPPH radical scavenging capacity and superoxide anion radical scavenging capacity，with more than 80% of GSH，and the hydroxyl radical scavenging ability of polypeptide reached more than 50%of GSH.Walnut protein and polypeptide were deter mined to have obvious antioxidant activity，and the antioxidant activity of walnut polypeptide was more significant.

walnut protein；walnut polypeptide；antioxidant activity；glutathione

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.001

2016-04-07

湖北省自然科學(xué)基金資助項目（2013CFB482）；湖北省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201312310012）；武昌理工學(xué)院校級項目（2015X04）作者簡介：李麗（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：生物多肽糖尿病藥物研究。

*通信作者：劉陽，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物分離分析及活性研究。