LASS2-3'-非翻譯區(qū)rs8444單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌易感性的相關(guān)性研究*

陳玉錦 王海峰 顏汝平 柯昌興 丁明霞 欒婷 鄒仁超 王劍松

·臨床研究與應(yīng)用·

LASS2-3'-非翻譯區(qū)rs8444單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌易感性的相關(guān)性研究*

陳玉錦①②王海峰①顏汝平①柯昌興①丁明霞①欒婷①鄒仁超①王劍松①

目的：探討人源性長(zhǎng)壽保障基因2（Homo sapiens longevity assurance homologue 2，LASS2）-3'-非翻譯區(qū)（UTR）單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)云南地區(qū)膀胱癌人群之間的相關(guān)性。方法：選擇2011年1月至2015年1月在昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診且經(jīng)病理學(xué)確診的105例膀胱癌作為膀胱癌組、100例非膀胱癌作為對(duì)照組進(jìn)行病例對(duì)照研究，對(duì)兩組患者的膀胱組織進(jìn)行基因擴(kuò)增和測(cè)序，分析研究LASS2-3'-非翻譯區(qū)單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌之間的相關(guān)性。結(jié)果：在LASS2-3'-非翻譯區(qū)僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)rs8444，經(jīng)χ2檢驗(yàn)和Logistic回歸分析顯示，膀胱癌組和對(duì)照組rs8444T/C等位基因頻率及基因型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.267，P=0.006；χ2=10.634，P=0.001）。與攜帶T等位基因或TT基因型相比，攜帶C等位基因或CC基因型的個(gè)體發(fā)生膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低（OR=0.489，95%CI為0.309～0.772，P=0.002；OR=0.258，95%CI為0.081～0.827，P=0.023），但與膀胱癌的TNM分期、病理分級(jí)和有否轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論：LASS2-3'-非翻譯區(qū)rs8444C等位基因和CC基因型可降低膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但與膀胱癌的TNM分期、病理分級(jí)和轉(zhuǎn)移情況無(wú)關(guān)。

LASS2 膀胱癌 多態(tài)性 單核苷酸

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在全球男性惡性腫瘤中位居第6位，每年全球有近429 800例新發(fā)病例和165 100例死亡病例，不同地區(qū)膀胱癌的發(fā)病率可相差10倍［1］。根據(jù)中國(guó)癌癥登記中心數(shù)據(jù)，2011年中國(guó)膀胱癌發(fā)病率為7.68/105、死亡率為1.99/105，膀胱癌發(fā)病率與死亡率均居泌尿系統(tǒng)腫瘤前列［2-3］。人源性長(zhǎng)壽保障基因2（Homo sapi?ens longevity assurance homologue 2，LASS2）位于染色體1q11，含有保守的TLC域和特定的HOX域，在促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用［4］。此前的研究結(jié)果［5］已證實(shí)，LASS2可明顯抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，其表達(dá)水平與膀胱癌細(xì)胞株侵襲能力呈負(fù)相關(guān)，在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌基因的作用。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是最常見(jiàn)的基因遺傳變異，通過(guò)改變基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)量影響基因?qū)C(jī)體的調(diào)控作用。目前有關(guān)LASS2基因多態(tài)性的研究較少［6］，尤其LASS2單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌相關(guān)性的研究國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。因此，本研究對(duì)膀胱癌患者的LASS2-3'-非翻譯區(qū)（LASS2-3'-UTR）進(jìn)行測(cè)序分析，探討SNPs與膀胱癌之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2011年1月至2015年1月105例昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診且確診為膀胱癌的患者，其中漢族90例、回族4例、白族3例、彝族3例、哈尼族2例、壯族1例、傣族1例、傈僳族1例。選取100例同期就診、經(jīng)膀胱鏡檢查后病理確診的非膀胱癌患者作為對(duì)照組，包括73例慢性膀胱炎、15例膀胱息肉、7例膀胱憩室、2例乳頭狀膀胱炎、2例膀胱結(jié)核和1例膀胱平滑肌瘤，排除其他惡性腫瘤史、有明確膀胱癌家族史、以及前列腺特異抗原（PSA）＞4 ng/mL的前列腺增生的患者，其中漢族87例、回族6例、彝族3例、納西族1例、白族1例、哈尼族1例、苗族1例。所有膀胱癌患者均首次診斷為原發(fā)性膀胱移行細(xì)胞癌，并根據(jù)2009年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（第7版）確定腫瘤的TNM分期，診療之前未經(jīng)過(guò)其他治療。膀胱癌組和對(duì)照組所選對(duì)象均為長(zhǎng)期居住于云南地區(qū)人群。所有的組織樣本一經(jīng)采集立刻置于液氮中，隨后保存于-80℃超低溫冰箱。所有試劑均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽屬知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 按照血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒中的操作說(shuō)明對(duì)收集的臨床組織樣本進(jìn)行全基因組DNA提取，將DNA濃度稀釋至20 ng/mL，-20℃保存。

1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR） 應(yīng)用Gene Bank檢索LASS2-3'-UTR序列，采用Primer Premer 5.0和Blast軟件設(shè)計(jì)并檢測(cè)LASS2-3'-UTR引物后，利用PCR混合液對(duì)總DNA進(jìn)行擴(kuò)增。LASS2上游引物為5'-CCAAAGCTGGACCAAGGCTA-3'；下游引物為5'-GCAAGGAAGGCATAAGAAAGACT-3'。PCR反應(yīng)體系為25 uL，包括20 ng基因組DNA、1×PCR緩沖液及400 nM上下游引物。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性0.5 min，95℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.2.3 DNA測(cè)序 PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%凝膠電泳檢測(cè)后，進(jìn)行測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析，檢測(cè)納入樣本的人群是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。SNPs和膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系采用非條件Logistic回歸分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

膀胱癌組共納入了105例患者，平均年齡為（60.95±9.62）歲，漢族90例，男性82例；對(duì)照組共納入了100例患者，平均年齡為（62.45±11.18）歲，漢族87例，男性74例。兩組資料均以漢族為主，年齡、民族、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），匹配性良好。

2.2 LASS2-3'-UTR基因序列分析

本研究對(duì)膀胱癌組與對(duì)照組患者的膀胱組織樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增和LASS2-3'-UTR序列測(cè)定和分析，并與Gene Bank檢索的LASS2-3'-UTR序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示僅在基因片段的120～140 bp位置發(fā)現(xiàn)rs8444T/C這一SNPs位點(diǎn)，而片段中其他則為堿基保守序列（圖1）。

2.3 Hardy-Weinberg平衡法則的吻合度檢驗(yàn)

膀胱癌組與對(duì)照組多態(tài)性位點(diǎn)的基因型觀察值與期望值檢測(cè)均符合Hardy-Weinberg平衡定律，吻合良好（P＞0.05），表明本研究對(duì)象來(lái)自大的群體，具有較好的代表性（表1）。

2.4 LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C等位基因頻率和基因型與膀胱癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

膀胱癌組和對(duì)照組LASS2-3'-UTR的rs8444位點(diǎn)T/C等位基因頻率及基因型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，膀胱癌組中攜帶C等位基因或CC基因型的比例均顯著低于對(duì)照組（均P＜0.01）。經(jīng)年齡、性別校正后，Logistic回歸分析結(jié)果顯示，與攜帶T等位基因或TT基因型相比，攜帶C等位基因或CC基因型者膀胱癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著降低；攜帶TC基因型者較攜帶TT基因型者膀胱癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

圖1 LASS2-3'-UTR測(cè)序結(jié)果Figure 1 Sequencing result for the SNP in LASS2-3'-UTR

表1 LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C基因型分布和等位基因頻率分布Table 1 T/C allele frequencies and genotype distributions of rs8444 in LASS2-3'-UTR

表2 LASS2-3'-UTR的rs8444多態(tài)性與膀胱癌的相關(guān)性Table 2 Relationship between rs8444 polymorphisms in LASS2-3'-UTR and bladder cancer risk

2.5 LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C等位基因頻率和基因型與膀胱癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

在納入的105例膀胱癌患者中，經(jīng)年齡、性別校正后，Logistic回歸分析結(jié)果顯示，LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C等位基因頻率和基因型分布與膀胱癌臨床分期、病理分級(jí)以及膀胱癌轉(zhuǎn)移與否均無(wú)明顯相關(guān)性（均P＞0.05，表3）。

表3 LASS2-3'-UTR的rs8444多態(tài)性與膀胱癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Table 3 Relationship between rs8444 polymorphisms in LASS2-3'-UTR and clinicopathological characteristics of bladder cancer

表3 LASS2-3'-UTR的rs8444多態(tài)性與膀胱癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性（續(xù)表3）Table 3 Relationship between rs8444 polymorphisms in LASS2-3'-UTR and clinicopathological characteristics of bladder cancer

3 討論

膀胱癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)有多因素參與、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，與遺傳、環(huán)境等因素密切相關(guān)，其分子機(jī)制目前尚不完全清楚。截至目前，已確認(rèn)多個(gè)與膀胱癌易感性相關(guān)的SNPs，如染色體3q28區(qū)域rs710521位點(diǎn)［7］以及前列腺干細(xì)胞抗原基因（prostate stem cell antigen，PSCA）的rs2294008和rs2978974位點(diǎn)［8］。此外，與膀胱癌易感性相關(guān)的SNPs也存在著種族和地域差異，如TP53基因密碼子72（TP53 Arg72Pro）多態(tài)性增加了南亞克什米爾人群的膀胱癌易感性［9］，但與北歐人群膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)［10］。

LASS2基因是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，與膀胱癌［5］、前列腺癌［11］、乳腺癌［12］等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前針對(duì)LASS2基因多態(tài)性的研究較少，除Amos等［6］研究發(fā)現(xiàn)LASS2基因1q21.3上的SNPs位點(diǎn)rs7412746是皮膚黑色素瘤的易感基因外，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)LASS2基因多態(tài)性與腫瘤相關(guān)性研究的報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)膀胱癌組與對(duì)照組患者的膀胱組織樣本進(jìn)行LASS2-3'-UTR測(cè)序，并與Gene Bank檢索的LASS2-3'-UTR序列進(jìn)行比對(duì)后僅發(fā)現(xiàn)rs8444 T/C這一SNPs位點(diǎn)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組和對(duì)照組LASS2-3'-UTR的rs8444位點(diǎn)T/C等位基因頻率及基因型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，膀胱癌組中攜帶C等位基因或CC基因型的比例均顯著低于對(duì)照組（59.52%vs.74.50%，χ2=10.634，P=0.001；35.24%vs.55%，χ2=10.267，P=0.006）；與攜帶T等位基因或TT基因型相比，攜帶C等位基因或CC基因型的個(gè)體可分別降低0.489倍或0.258倍的膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR=0.489，95%CI為0.309～0.772，P=0.002；OR= 0.258，95%CI為0.081～0.827，P=0.023）。此外，本研究對(duì)LASS2-3'-UTR的rs8444位點(diǎn)T/C等位基因頻率及基因型與膀胱癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性也進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C等位基因頻率和基因型分布在不同的臨床分期、病理分級(jí)和有否轉(zhuǎn)移的膀胱癌患者間無(wú)顯著性差異（均P＞0.05）。以上結(jié)果初步提示LASS2-3'-UTR的rs8444位點(diǎn)C等位基因和CC基因型可降低膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但與膀胱癌臨床分期、病理分級(jí)和有否轉(zhuǎn)移等無(wú)明顯相關(guān)性。

眾所周知，基因通過(guò)3'-非翻譯區(qū)與其上游的miRNA靶向結(jié)合，基因mRNA降解或翻譯抑制依賴于其上游miRNA表達(dá)量，以及基因mRNA轉(zhuǎn)錄本和miRNA之間的互補(bǔ)程度［13］。即使靶基因3'-非翻譯區(qū)只發(fā)生了單個(gè)核苷酸的改變，都有可能破壞原有的或產(chǎn)生新的miRNA靶基因結(jié)合位點(diǎn)，影響腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)［14］，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展［15］。因此本研究推測(cè)，LASS2-3'-UTR的rs8444位點(diǎn)C等位基因和CC基因型通過(guò)改變上游miRNA與LASS2基因的結(jié)合能力甚至是結(jié)合位點(diǎn)，增加LASS2轉(zhuǎn)錄后水平的活性，使LASS2基因表達(dá)增加，從而降低膀胱癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)；LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C多態(tài)性與膀胱癌進(jìn)展無(wú)明顯相關(guān)性，可能是由于膀胱癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制復(fù)雜多變，單一基因多態(tài)性并不能完全解釋腫瘤的進(jìn)展。此外本項(xiàng)研究尚有一定局限性：1）本研究是以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究，固有的選擇偏差不能完全排除；2）本研究非大樣本數(shù)據(jù)研究，樣本量的適中削弱了分層分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)強(qiáng)度；3）云南雖然是個(gè)多民族地區(qū)，但本組資料仍以漢族為主，其他少數(shù)民族病例數(shù)過(guò)少，限制了對(duì)民族因素的進(jìn)一步分析。

綜上所述，LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C多態(tài)性與膀胱癌易感性密切相關(guān)，但與腫瘤進(jìn)展無(wú)關(guān)；C等位基因和CC基因型可降低膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，可能是膀胱癌的一個(gè)新的保護(hù)因素。下一步將對(duì)LASS2-3'-UTR的rs8444 T/C多態(tài)性影響膀胱癌易感性的可能機(jī)制進(jìn)行深入研究，并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，探討與少數(shù)民族交互的關(guān)系。

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（2016-10-27收稿）

（2017-01-16修回）

Analysis of the correlation between rs8444 polymorphisms located within LASS2-3′-UTR and susceptibility of bladder cancer

Yujin CHEN1,2,Haifeng WANG1,Ruping YAN1,Changxing KE1,Mingxia DING1,Ting LUAN1,Renchao ZOU1,Jiansong WANG1
Correspondence to:Jiansong WANG;E-mail:jiansongwang@126.com

1Department of Urology,The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Yunnan Institute of Urology,Kunming 650101, China;2Department of Nephrology,New District Hospital of People's Hospital of Chuxiong Yi Autonomous Prefecture,Chuxiong 675000,China

This work was supported by the Project of Yunnan Provincial Science and Technology(No.2015FB196)and the Yunnan Provincial Department of Education Fund(No.2014Z072)

Objective:To explore the correlation between single nucleotide polymorphisms(SNPs)in Homo sapiens longevity assurance homologue 2(LASS2)gene 3′‐untranslated regions(UTR)and susceptibility of bladder cancer among residents of Yunnan,China.Methods:A total of 105 bladder cancer patients(bladder cancer group)and 100 nonbladder cancer patients(control group)were selected.PCR method and sequence for LASS2-3′‐UTR were performed to identify the SNPs correlated with bladder cancer.The relationships between the LASS2-3′‐UTR polymorphisms and bladder cancer risk were analyzed.Results:An SNP(rs8444)was identified in LASS2-3′‐UTR,and the T/C allele frequencies and genotype distributions of rs8444 largely differed between the bladder cancer and control groups(χ2=10.267,P=0.006;χ2=10.634,P=0.001).Individuals that carry the rs8444 C allele or CC genotype had a remarkably lower risk of bladder cancer compared with those that carry the T allele or TT genotype(OR=0.489,95%CI:0.309-0.772,P=0.002;OR= 0.258,95%CI:0.081-0.827,P=0.023).No significant correlations were observed between the T/C allele frequencies and genotype distributions of rs8444 and TNM stage,as well as histological grade and distant metastasis in bladder cancer(P＞0.05).Conclusion:The rs8444 C allele or CC genotype located within LASS2-3′‐UTR can lower the susceptibility of bladder cancer among the residents of Yunnan,China.However,it is not associated with the TNM stage,histological grade,and distant metastasis.

Homo sapiens longevity assurance homologue 2,bladder cancer,polymorphism,single nucleotide

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.03.240

①昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，云南省泌尿外科研究所（昆明市650101）；②云南省楚雄州人民醫(yī)院新區(qū)腎臟內(nèi)科

*本文課題受云南省科技計(jì)劃（編號(hào)：2015FB196）和云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（編號(hào)：2014Z072）資助

王劍松 jiansongwang@126.com

陳玉錦 專業(yè)方向?yàn)榘螂装┑呐R床治療及基礎(chǔ)研究。

E-mail：yncxcyj@sina.com