循環(huán)腫瘤細胞檢測與結(jié)直腸癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的研究進展

白東曉 綜述 楊海軍 審校

·綜 述·

循環(huán)腫瘤細胞檢測與結(jié)直腸癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的研究進展

白東曉①綜述 楊海軍②審校

結(jié)直腸癌發(fā)病率在逐年上升，轉(zhuǎn)移和復發(fā)是結(jié)直腸癌死亡的主要原因。血液循環(huán)中的腫瘤細胞可能具有增生能力或轉(zhuǎn)移潛能，循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）的檢測為預(yù)測評估復發(fā)轉(zhuǎn)移及療效、腫瘤分期及個體化治療提供了一個可靠手段，隨著檢測技術(shù)的不斷優(yōu)化發(fā)展，將為臨床提供更好的支持。本文旨在對CTC檢測與結(jié)直腸癌復發(fā)轉(zhuǎn)移等方面的研究進展進行綜述。

循環(huán)腫瘤細胞 結(jié)直腸癌 檢測技術(shù) 復發(fā)轉(zhuǎn)移 腫瘤分期 療效評估

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）是指存在于血液循環(huán)中的腫瘤細胞和轉(zhuǎn)移來源的細胞。在結(jié)直腸癌患者血液中的CTC不僅包括上皮腫瘤細胞，也包括經(jīng)歷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchy?mal transition，EMT）的腫瘤細胞和腫瘤干細胞［1］。大量早期的結(jié)直腸癌患者雖然經(jīng)過根治性手術(shù)，但仍發(fā)生復發(fā)轉(zhuǎn)移，這提示一些具有生命力的腫瘤細胞包括具有增生能力或轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細胞被釋放入血液。CTC的檢測將有助于腫瘤的分期診斷以及評估轉(zhuǎn)移復發(fā)的可能性，為個體化治療提供依據(jù)，并且可以觀察輔助治療的效果。本文旨在對結(jié)腸直腸癌CTC的研究進展進行綜述。

1 CTC

盡管實體腫瘤能夠脫落數(shù)以百萬計的腫瘤細胞進入血液［2］，但所檢測到的腫瘤細胞卻寥寥無幾。因為大部分的腫瘤細胞在循環(huán)過程中發(fā)生凋亡或很快被血液中的NK細胞、單核細胞、巨噬細胞及中性粒細胞所殺傷吞噬。惡性腫瘤細胞為獲得運動性和侵襲性，會丟失某些上皮細胞的表型，包括形態(tài)、表面抗原、基因表達等，并獲得某些間充質(zhì)細胞的表型，這就是EMT。

有研究表明，CTC多個基因的表達改變與結(jié)直腸癌細胞的轉(zhuǎn)移遷徙有關(guān)，如TSPAN8［3］、CD44v6［4］、CD151［5］的下調(diào)，具有很強的細胞毒性和噬菌性的鈣網(wǎng)蛋白的下調(diào)［6］，以及過度表達CD47的無免疫表型［7-8］。已有研究證明，骨髓中的CD47陽性CTC與腫瘤的復發(fā)有關(guān)［9-10］。發(fā)生基因表達改變的CTC能夠避開免疫細胞的細胞毒性及吞噬。

多數(shù)惡性腫瘤細胞在脫離原發(fā)病灶的過程中發(fā)生EMT。關(guān)于EMT發(fā)生的機制，有研究報道能誘發(fā)EMT轉(zhuǎn)換的信號可以通過蛋白磷酸化機制，如TGF-β信號通路導致的PAR6A蛋白磷酸化，破壞緊密連接和橋粒連接［11］。還可以通過抑制某些蛋白的表達水平，如ZEB1抑制血小板親和蛋白3來誘發(fā)EMT轉(zhuǎn)換。細胞外基質(zhì)的重構(gòu)也能觸發(fā)EMT過程［12］。CTC cluster是指3個或3個以上的CTC聚集在一起形成的腫瘤細胞聚合體。CTC cluster與間質(zhì)細胞表型密切相關(guān)，并且高比例的間質(zhì)細胞表型CTC與化療耐藥有關(guān)［13］。研究顯示CTC cluster比單個腫瘤細胞具有更強的轉(zhuǎn)移潛能［14］。Aceto等［15］研究指出，外周血檢出CTC cluster的患者較僅檢出單個CTC患者轉(zhuǎn)移風險高23～50倍。

2 結(jié)直腸癌CTC的檢測方法的進展

結(jié)直腸癌CTC的檢測方法，根據(jù)檢測原理可分為細胞計量術(shù)及基于核苷酸的檢測方法。根據(jù)檢測前是否采用免疫磁珠等技術(shù)富集血液標本中的腫瘤細胞而將所有的檢測方法分為陽性富集法和陰性富集法。

2.1 細胞計量術(shù)及基于核苷酸的檢測方法

前者包括各種免疫細胞化學技術(shù)、免疫磁珠分離技術(shù)、流式細胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）、基于癌細胞大小的分離方法等。后者包括多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR），逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR）及其各種改進的技術(shù)如Southern blot雜交、Northern blot雜交肽配體篩選的技術(shù)等。主要是基于抗原抗體，EMT原理來篩選陽性細胞CTC細胞，PCR、Northern、FISH等后續(xù)檢測方法。目前，應(yīng)用較多的是RT-PCR，其具有高度的敏感性和特異性，但由于RNA易被RNA酶降解，同時該方法具有PCR技術(shù)的局限性，仍可出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。

FCM以流式細胞儀為工具對懸液中的細胞進行測量分析，具有快速、準確的優(yōu)點，盡管FCM不能提供有關(guān)細胞形態(tài)方面的信息，但其在鑒定、計數(shù)腫瘤細胞方面比RT-PCR更可靠。其缺點為FCM需取約50 mL外周血方可檢測CTC。

2.2 細胞富集術(shù)

根據(jù)檢測前是否采用免疫磁珠等技術(shù)富集血液標本中的腫瘤細胞而將所有的檢測方法分為陽性富集法和陰性富集法。哈佛大學韋斯研究所仿生工程與波士頓AOS醫(yī)院之間合作研究創(chuàng)造一種微流體裝置，可以收集稀少的CTCs，以便進一步進行血液分析。這種陽性富集法方法采用細胞分離裝置與微磁學和微流體相結(jié)合捕捉和培養(yǎng)CTCs，磁珠有選擇性地涂布CTCs以便分離血液中的其他細胞［16］。但進一步測試發(fā)現(xiàn)該設(shè)備對檢測CTCs的數(shù)量不夠敏感。有研究采用一種改進的微流體系統(tǒng)把正常的血細胞過濾除去，留下無損傷的腫瘤細胞［17］。

Cell Search CTC檢測與分析系統(tǒng)，能夠運用免疫納米磁顆粒專利技術(shù)對微量細胞進行分析。該系統(tǒng)能夠?qū)ρ褐械奈⒘考毎M行精確分析，并且具有良好的可重復性和特異性，只需應(yīng)用7.5 mL血液樣本，即可從400多億的血細胞中檢測到一個CTC，敏感性較高。Cell Search是基于陽性選擇，利用抗體包被的磁珠來捕獲EpCAM陽性的細胞，然后成像并計數(shù)。2004年Cell Search CTC檢測技術(shù)獲得美國FDA的認證，2007年美國臨床腫瘤學會（ASCO）將CTC納入腫瘤標志物，2012年國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準Veridex CTC檢測，2013年CTC檢測納入美國醫(yī)保［18］。

目前，CTC檢測方法較多，但檢出率仍有限，仍需提高其陽性率及特異性。為避免使用單一方法檢測的種種弊端，近些年多使用兩種或多種方法聯(lián)合檢測。如采用陰性富集法、免疫熒光染色技術(shù)、FISH等方法聯(lián)合檢測CTC、CTC Cluster及疑似細胞。最近有報道聯(lián)合應(yīng)用細胞搜索系統(tǒng)方法提高轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中的CTC檢測率，以更好的指導臨床治療［19］。

3 檢測CTC在結(jié)直腸癌臨床中的意義

3.1 CTC的檢測有助于腫瘤的分期

早期結(jié)直腸癌（Ⅰ期和Ⅱ期）通過根治性的外科手術(shù)治愈率可達70%［1］。在Ⅰ期和Ⅱ期結(jié)直腸癌術(shù)后腹腔灌洗液中傳播腫瘤細胞陽性者的預(yù)后明顯較差。Ⅲ期腫瘤患者中CTC陽性者有較短的無病生存期（disease-free survival，DFS），并且CTC的檢測可以作為Ⅲ期的f分層分期的依據(jù)［20］。進展期結(jié)直腸癌，隨著分期的增高，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的陽性CTC細胞檢測率越來越高［21］。在非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中，檢測到的CTC平均數(shù)目隨著腫瘤的T分級、N分級、腫瘤大小、分化程度的惡性升高而增加，而與患者的性別、年齡、CEA水平及大體類型無關(guān)［22］。

3.2 CTC作為結(jié)直腸癌的一個獨立預(yù)后因素

CTC檢測能否作為結(jié)直腸癌患者的預(yù)后指標，一項應(yīng)用5個收索引擎、匯集1 847例結(jié)直腸癌患者的Meta分析［23］給出答案。應(yīng)用細胞搜索系統(tǒng)檢測外周血的CTC能夠有效地評估結(jié)直腸癌患者的預(yù)后，外周血CTCs的存在與患者的總生存期（overall survival，OS）和無進展生存期（progression-free survival，PFS）有明確的相關(guān)性。在早期結(jié)直腸癌患者中，CTC檢測與患者的預(yù)后關(guān)系尚未完全闡明，但在進展期患者中，尤其是Ⅲ期及轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中，檢測的CTC數(shù)目是一個獨立預(yù)后因素［24-25］，3個或3個以上的CTC/7.5 mL比3個以下的有較短的PFS和OS。

3.3 個體化治療的依據(jù)

在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，檢測CTC更有意義。因為CTC的分子特征尤其在細胞黏附、EMT方面更能比原發(fā)腫瘤細胞提示遠處轉(zhuǎn)移的跡象［26］。有報道應(yīng)用磁珠、熒光分離技術(shù)（MACS和FACS）及RT-qP?CR方法檢測結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者冷凍術(shù)前及術(shù)后1、7、30 d的外周血CTC數(shù)值，冷凍的術(shù)后CTC數(shù)值明顯下降，與CTC相關(guān)的CEA、Ep-CAM、CK18和CK19隨時間推移也明顯下降，這種方法檢測CTC對冷凍術(shù)的療效評估及進展期結(jié)直腸癌的預(yù)后判定有一定價值［27］。CTC的檢測，為結(jié)直腸癌個體化治療提供一個相對可靠的依據(jù)。

3.4 治療效果的評價

接受化療的進展期結(jié)直腸癌患者可以通過表達CK20和存活素的CTC檢測，有效地預(yù)測患者的OS［28］。結(jié)直腸癌根治術(shù)后，通常CTC水平會下降，但若仍較高水平或繼續(xù)增加者，則確定提示腫瘤會復發(fā)轉(zhuǎn)移，警示要優(yōu)化該患者的治療方案［29］。對于Ras-Braf野生型的進展期化療難治患者，應(yīng)用西妥昔單抗、帕尼單抗三線治療期間，治療早期（2～4周）CTC陽性的患者，比CTC陰性者其PFS明顯縮短；治療期間的CTC變化與OS及PFS明顯相關(guān)［30］。通過對比結(jié)直腸癌患者治療前后的CTC變化，可以判斷其治療效果。

4 結(jié)語與展望

腫瘤復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者的主要死亡原因。如何檢測微轉(zhuǎn)移和早期復發(fā)是CTC檢測有效與否的關(guān)鍵因素。目前，對腫瘤細胞的異質(zhì)性、侵襲性、血液轉(zhuǎn)移的機制尚未完全闡明。CTC檢測在結(jié)直腸癌臨床研究中已經(jīng)取得一定的進展，但CTC的檢測靈敏度及特異性仍有待提高。CTC檢測的結(jié)果如何轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，如對早期診斷、藥敏、耐藥、轉(zhuǎn)移、復發(fā)等相關(guān)的不同CTC亞類細胞進行全面的基因分析，以期能夠加深對腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移等多方面的了解，并尋找出新的腫瘤標志物，從而提高這種“液體活檢”的有效率。

綜上所述，CTC檢測前景良好，隨著研究的不斷發(fā)展，必將產(chǎn)生新的診療手段，為腫瘤的防治提供更好的支持。

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（2016-08-16收稿）

（2016-09-28修回）

Advances in circulating tumor cells detection and the colorectal cancer recurrence or metastasis

Dongxiao BAI1,Haijun YANG2

Dongxiao BAI;E-mail:ljty417bai@163.com

The occurrence rate of colorectal cancer is increasing.Metastasis and recurrence are the leading causes of death in colorectal cancer.Tumor cells in the circulation have the ability to proliferate or to migrate,thereby providing a reliable means for neoplasm staging and assessment of recurrence or metastasis,and evaluation of efficacy by detecting circulating tumor cells(CTC).Optimizing the development of detection technology will provide better support for clinical applications.This review mainly discusses CTC detection and advances in colorectal cancer relapse or metastasis.

circulating tumor cells,colorectal cancer,detection technology,recurrence and metastasis,neoplasm staging,efficacy evaluation

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.03.966

①安陽市腫瘤醫(yī)院，河南科技大學第四附屬醫(yī)院外四科（河南省安陽市455000）；②病理科

白東曉 ljty417bai@163.ckom

1The Fourth Surgical Department of Anyang Tumor Hospital,The Fourth Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Anyang 455000,China;2Department of Pathology,The Fourth Surgical Department of Anyang Tumor Hospital,The Fourth Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Anyang 455000,China

白東曉 專業(yè)方向為胃腸腫瘤的臨床及基礎(chǔ)研究。

E-mail：ljty417bai@163.com